《續(xù)》

 

 

　　RAPD-PCR（the random amplified polymorphicDNA-PCR）也稱作AP-PCR（arbitrary primer PCR）是一種用任意的隨機(jī)引物來(lái)檢測(cè)DNA序列圖譜的檢測(cè)方法。由RAPD-PCR得出的特殊且特定的模型可以用來(lái)區(qū)分肉類的物種。RAPD-PCR不僅擁有簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好、敏感度高、辨識(shí)性高等優(yōu)點(diǎn)，并且可以在單次的PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種的DNA。這種分析方法也適用于識(shí)別在不同的加工條件下的肉類和肉類產(chǎn)品的物種。

　　使用種特異性PCR（ species-specific PCR）鑒定肉和肉制品的物種比其他的PCR檢測(cè)方法更加的簡(jiǎn)便、靈敏和快速。然而，單次PCR反應(yīng)可檢測(cè)的物種數(shù)量卻被降低。這種PCR方法可以通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)DNA或線粒體DNA來(lái)鑒定肉的種類。豬的特異性DNA引物已被成功用來(lái)鑒定各種肉和肉產(chǎn)品，如生肉、熟肉、香腸、腌肉產(chǎn)品和漢堡包等[32]。種特異性PCR方法由于其操作簡(jiǎn)單、高特異性和高靈敏度，是一個(gè)強(qiáng)大的牛肉鑒定手段，在加工和未加工的食物中皆適用。

　　線粒體DNA的12S rRNA，16S rRNA，d循環(huán)（D-loop）和細(xì)胞色素b區(qū)域（cytochrome b regions）

　　一般被用作目標(biāo)物種鑒別的目標(biāo)區(qū)域。通過(guò)使用設(shè)計(jì)在細(xì)胞色素b基因上的引物，種特異性PCR已成功應(yīng)用于檢測(cè)和區(qū)分食品中的雞、火雞、豬、牛和羊的成分。

　　PCR-RFLP技術(shù)（the restriction fragment lengthpolymorphis），即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，其基原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對(duì)特異性，而且方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短。但這種技術(shù)較為復(fù)雜的，并需要相配的實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格的分析技術(shù)和昂貴的酶。然而，這種分析方法針對(duì)熟肉的鑒定有著較大的潛能。有試驗(yàn)證明，PCR-RFLP可在肉類混合物中，鑒定出不到1%的水平的雞和火雞肉。同樣，羊肉和山羊肉也可通過(guò)使用ApaI限制酶的PCR-RFLP分析來(lái)區(qū)分。

　　針對(duì)線粒體DNA使用PCR-RFLP技術(shù)，可以鑒別經(jīng)過(guò)鹵水、熱處理和發(fā)酵的近緣的肉制品，包括豬、牛、野豬、野牛、綿羊、山羊、馬、雞、火雞和野味等。然而，絕大多數(shù)的RFLP方法是適合用來(lái)定性檢測(cè)單一物種的肉，而混合物會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的指紋，并不容易解讀。

　　復(fù)合PCR技術(shù)（multiplex PCR）采用多對(duì)引物對(duì)目標(biāo)基因與線粒體DNA進(jìn)行測(cè)定，可以同步、準(zhǔn)確和快速的在單次PCR反應(yīng)中識(shí)別多個(gè)肉類品種。已有文獻(xiàn)表明，復(fù)合PCR可以用來(lái)識(shí)別雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、羊肉、驢肉和馬肉，其對(duì)熟肉和加工肉類的檢出限為1%。Dalmasso使用設(shè)定在線粒體12s rRNA基因的正向引物和特異性反向引物鑒定鵝、土番鴨、雞、的火雞和豬。

　　另有試驗(yàn)使用設(shè)定在5S rRNA基因正向引物和 特異性反向引物鑒定出混合在鵝肝中的鴨肝。

　　常規(guī)的PCR技術(shù)雖然可以對(duì)不同物種的混合肉類進(jìn)行定性檢測(cè)，但卻不能實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品中的物種進(jìn)行定量。而Real-Time PCR（又稱實(shí)時(shí)定量熒光PCR）不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。

　　有研究證實(shí)，通過(guò)對(duì)放大的線粒體12S rRNA基因、細(xì)胞色素b基因及16S rRNA基因進(jìn)行Real-TimePCR試驗(yàn)可以鑒別混合肉中肉的成分。而設(shè)計(jì)后的探針可以定量的分析馬肉、驢肉和豬肉的混合物，并且不局限于食物是否經(jīng)過(guò)加工和現(xiàn)今實(shí)驗(yàn)人員可以通過(guò)對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序來(lái)鑒定已知序列的肉類物種。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)人員的不斷測(cè)序分析，現(xiàn)今已有大量的常見動(dòng)物物種、品種和基因變異的基因序列存于數(shù)據(jù)庫(kù)中，如美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫(kù)等。

　　只要物種擁有獨(dú)特的DNA序列，DNA測(cè)序都可以對(duì)其進(jìn)行鑒定，就算是沒(méi)有任何參考資料的未知樣品也同樣可以進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)方法為先通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)得到樣品的DNA序列，然后將其與數(shù)據(jù)庫(kù)中的大量已知物種信息進(jìn)行比對(duì)，就可以得到樣品的物種。通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)識(shí)別 DNA序列是一種非常直接和有效的方式，通常會(huì)伴隨著凝膠電泳，并使用 Real-Time PCR對(duì)其結(jié)果進(jìn)行定量分析。傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)是通過(guò)雙脫氧鏈終止法對(duì)PCR反應(yīng)完成時(shí)產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行的末端分析，得出模板鏈的堿基序列。然而由于Sanger測(cè)序法操作繁瑣、成本較高，不能滿足大規(guī)模測(cè)序的需要。新一代的測(cè)序方法則以高通量、低成本為主要特點(diǎn)，主要包括Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)、羅氏公司的454測(cè)序技術(shù)和ABI公司的SOLiD測(cè)序技術(shù)等，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

　　2003年，加拿大Guelph大學(xué)的生物學(xué)家Paul Hebert教授首次提出利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶1（cytochromeC oxidase 1）基因構(gòu)建物種鑒別體系，而這段擁有648個(gè)堿基對(duì)的基因序列則被稱為DNA條形碼（通常被簡(jiǎn)稱作CO1或COI），并期待像在零售業(yè)的發(fā)展過(guò)程中起到了舉足輕重作用的條形碼技術(shù)一樣，根據(jù)對(duì)1個(gè)統(tǒng)一的目標(biāo)基因DNA序列的分析來(lái)完成物種鑒定的過(guò)程。

　　截止2011年已有112547種動(dòng)物和近43 000植物、真菌和其他類型生物的DNA條形碼已存入數(shù)據(jù)庫(kù)中，并且這個(gè)數(shù)字還在不斷增加。DNA條形碼作為對(duì)地球上現(xiàn)有物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)， 受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。

　　在美國(guó)，為規(guī)范魚類交易，避免以次充好，美國(guó)食品和藥物管理局2011年年底宣布它將擴(kuò)大其使用DNA檢測(cè)在檢查海鮮制造商和餐館。

　　現(xiàn)階段可用于確定 肉類品種的方法大致可以分為5種： 物理技術(shù)、化學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、電泳技術(shù)、以及DNA鑒定技術(shù)。這些檢測(cè)方法是基于肉類品種之間的解剖差異、化學(xué)分析、蛋白質(zhì)或DNA鑒定而建立的。

　　物理和化學(xué)技術(shù)適合用于鑒定較為完整的生肉，并可以通過(guò)物理方法按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肉類的品質(zhì)進(jìn)行分級(jí)，并由于其操作簡(jiǎn)便，較為適用于現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法工作。而碎肉、肉末以及僅經(jīng)過(guò)適度加工的肉則適合采用免疫學(xué)和電泳方法，如SDS-PAGE、IEF和ELISA。

　　但是對(duì)于經(jīng)過(guò)熱加工的肉類而言，由于熱加工會(huì)使肉類的蛋白質(zhì)變性，因此基于DNA的檢測(cè)方法擁有著更高的可靠性，如傳統(tǒng)的DNA分析和實(shí)時(shí)PCR等。線粒體和基因組中的DNA均可以通過(guò)單拷貝和重復(fù)序列的方法PCR擴(kuò)增序列，具體方法的選擇會(huì)極大程度的受到檢測(cè)極限的影響。如果需要定量的鑒定肉的種類，則需要選用基于實(shí)時(shí)PCR分析方法。最新的DNA條形碼技術(shù)正受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，目前已越來(lái)越多的在肉類物種的鑒定和執(zhí)法工作中采用。