關鍵詞：肉類摻假; 物理技術; 電泳技術; DNA聚合酶鏈反應; DNA條形碼

從近年來屢次曝光的羊肉摻假，到2013年歐洲的“馬肉丑聞”，再到2014年國內沃爾瑪的“驢肉摻假門”，各種肉類摻假的事件層出不窮，使得百姓們對肉類的食品安全問題甚為擔憂。要杜絕“摻假肉”上餐桌，光靠末端檢查是不能從根上解決問題的，最關鍵的還是要不斷完善法律法規(guī)，加強監(jiān)管和執(zhí)法手段，對危害食品安全的行為狠狠打擊。現今，我國對這些“摻假肉”的制作加工沒有任何標準可循，它一直被歸納到“餐飲行業(yè)”的管理范圍內。隨著食藥總局的成立，食品安全分段監(jiān)管將成為歷史，但肉的真假仍然沒有任何法律追溯。要想打擊“摻假肉”的泛濫問題，首先要制定統一的檢測方法，執(zhí)法人員和檢測機構才能有依據去辨別市場上的真假肉，因此盡快研究出臺肉類的鑒別檢測方法刻不容緩。

　　一直以來，研究人員都在致力于開發(fā)出一種簡單、靈敏、快速并且低成的分析方法來檢測鑒定肉和肉產品的種類和品質。到目前為止，這些方法的開發(fā)是基于肉類的解剖學和組織學特征，蛋白質的檢測特異性及其相關技術，如電泳法，等電點法（IEF）和酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）等。然而，這些方法并不是通用的方法，僅適用于特定情況。并且，這些方法是昂貴、耗時、復雜，缺乏特異性，只適用于對新鮮肉類。而免疫學的方法，尤其是酶聯免疫吸附劑測定法和側流免疫測定法，由于其專一性、簡單性且靈敏度高，在過去的一段時間內被普遍采用來測定肉類的種類；然而，由于肉蛋白質在加熱后會發(fā)生熱變性，因此這些免疫學的方法在檢測經過高溫的肉制品時并不能得到令人滿意的結果。目前，由于DNA的高溫穩(wěn)定性和高度守恒的性質，DNA分析法已廣泛用于肉類的品種鑒定。最初，檢測研究人員使用DNA雜交法測定肉的種類，但由于DNA雜交法操作復雜和耗時長，現在正被在DNA聚合酶鏈反應（PCR）檢測法所替代。DNA分析法是準確、快速、低成的，并在所有情況下普遍適用。分別從物理技術、化學技術、免疫學技術、電泳技術、以及DNA技術等角度，對國內肉類摻假檢測鑒定技術的研究進展進行了綜述，為進一步的研究工作及標準制定提供一定的參考。

　　1 物理技術

　　物理檢測方法主要是通過辨別每個物種畜體的解剖差異，如肌肉和脂肪的外觀、顏色、氣味、質地和味道等為肉類的品種和品質鑒定提供一個初步的判斷。現今有大量的物理方法可以針對肉類結構的不同關鍵信息進行檢測，通過對檢測結果的比對可以對肉類的品種和品質進行鑒定，特別是適合用來評估肉的品質。物理鑒別的方法由于操作簡便，比較適用于現場執(zhí)法工作，表1將這些不同類型的物理方法進行了匯總并針對其主要的優(yōu)點和缺點進行了評估。

　　表1 肉類的物理檢測方法匯總及其主要的優(yōu)缺點

　　2 化學技術

　　根據不同物種肉類之間的差異性，化學測試可以很容易地檢測出肉類的品種。例如，由于牛肉和水牛肉中的胡蘿卜素含量不同，可依此來執(zhí)行 印度的防止牛屠宰法（見表2）。此外，由于馬肉中的糖原含量大于其他的肉類，可通過化學檢測來鑒定肉的品種。但由于糖原在屠宰后會消失，并且動物的肝臟中也存在一定量的糖原，當混合在香腸中時會干擾測定結果[10]。因此，可以結合表2中的數據，將馬肉的糖原測定應結合亞油酸的含量、脂肪中的碘含量以及脂肪的折射率的測定結果進行綜合判斷。

　　表2 不同的肉類品種中不同的化合物的含量

　　3 電泳技術

　　血清學的和電泳的方法已被確認是可以區(qū)分原料肉的種類的方法。電泳方法專注于分離和染色特定的蛋白質，但由于蛋白質的變性，難以分析經過熱處理的肉類樣品。電泳是一種強大的用于分離蛋白質的研究技術，其分離的蛋白質通常作為分離凝膠中可視的特異蛋白帶，必要時，可以通過簡單的非特異性染色、酶學方法或免疫學方法。分離是取決于同質凝膠、濃度梯度凝膠、pH梯度凝膠或變性劑的使用。用于物種識別的有效應用方法包括基于原料肉的水提取物中有色的肌紅蛋白帶的等電勢或在特定的可視化后適當的種專一性的同功酶之間的區(qū)別。電泳數據的解釋會受到酶蛋白色層圖的視覺復雜度的影響。

　　3.1 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE）

　　SDS-PAGE被廣泛使用，用于分離蛋白亞基和測定其分子量。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成SDS-多肽復合物，由于SDS-多肽復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度進入聚丙烯酰胺凝膠，其移動速度取決于多肽的分子量。SDS-PAGE可用來在肉的混合物或商業(yè)香腸中識別肉的種類，也可以用來識別熟的魚的種類。這項技術使得研究人員能夠識別以下的肌纖維和肌質肌肉蛋白質：肌球蛋白和肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白輔肌動蛋白。

　　3.2 等電點聚焦（IEF）

　　等電點聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當蛋白質放進此體系時，不同的蛋白質即移動到或聚焦于與其等電點相當的pH位置上。

　　使用IEF PAGE從加熱后的牛肉和豬肉的混合物中發(fā)現含有10%的豬肉。通過 等電點聚焦肉的混合物可以成功得到蛋白質表達譜，從而通過多元數據分析來區(qū)分牛肉和豬肉。然而，當肉被同一物種但是更為廉價的材料所替代時，難以通過等電點聚焦來區(qū)分肉的不同品質。好處則是評估樣是不依賴于個體成分的特定知識，所以這種分析方法在任何標準實驗室中都相對容易實現。

　　4 免疫學技術

　　基于非常特殊的抗原抗體間的相互作用， 免疫試驗可以檢出并確定復雜混合物如食品提取物中特定的分析[20]?，F今，最常用的2個免疫學技術為瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID，agar gel immune-diffusion）和最新的酶聯免疫吸附試驗（ELISA，enzyme linkedimmuno-sorbent assay）。

　　4.1 瓊脂免疫擴散試驗（AGID）

　　AGID采用了一個雙擴散技術，是將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應的小孔中，兩者各自向四周擴散，如抗原與抗體相對應，兩者相遇即發(fā)生待異性結合，并在比例適合處形成白色沉淀線。通過AGID可以用已知抗體（或抗原）檢測未知抗原（或抗體），可鑒定抗原性物質或免疫血清的濃度、純度及比較抗原之間的異同點。1977年Hayden就通過開展AGID在熟牛肉香腸中檢測出1%，3%和5%的雞肉。雖然AGID已被公眾所認可，并廣泛應用于肉類的檢測，但是卻存在著局限性。因為該法無法檢測近緣物種，并且獲取結果的時間太長，從采樣到收到結果需要約96 h。

　　4.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

　　ELISA是幾種不進行沉淀程序的定性的免疫學技術之一，將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結果。ELISA測試快速，并且對于低到2%的摻假識別高度敏感。ELISA一直用來定性和定量的研究生物體液和組織樣品中的多種抗原和抗體。

　　通過識別同源物種蛋白質來鑒別肉類品種的ELISA方法有3個：形間接ELISA、 雙抗體夾心（DAS，doubleantibody sandwich） ELISA和競爭ELISA。

　　4.2.1 間接ELISA

　　該技術首先用特異性抗原包被固相載體，加入待測的抗體，使之與包被在固相載體上的抗原結合，再加入酶標記的第二抗體，使之與待測抗體結合；反應后再加入底物顯色，顏色的深淺與標中待測抗體的量成正比。當用于測定含有約3%摻假的肉類物種時，間接ELISA是一個完善的基礎系統。

　　4.2. 2 DAS-ELISA

　　DAS-ELISA的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，判斷抗原含量。DAS-ELISA已被改良其特異性和靈敏度，可用來檢測含約0.5%摻假的肉類。

　　4.2.3 競爭ELISA

　　競爭ELISA形式，這種形式涉及到肉類提取物預培養(yǎng)技術的應用（試驗抗原與已知數量的特異性抗體在PBST中培養(yǎng)）到抗原涂層板。在這種檢測技術中，抗原或抗體中的一個被標記上檢測分子，如放射標記125I、HRP、AP或熒光分子等。由于待測物中存在與相應抗原或抗體相同的競爭性分子，因而標記后的檢測分子可以被競爭性地洗脫，從而信號值相應降低，達到檢測的目的。

　　5 DNA鑒定技術

　　5.1 DNA雜交技術

　　DNA雜交技術通常用于識別肉的物種。雜交的雙方是所使用的探針和待檢的核酸。檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細胞總DNA或總RNA。探針必須經過標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素， 但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法，例如，使用熒光分子。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，可以用來鑒定熟肉的物種，但是對于近緣物種并不能很好地分辨。Ebbehoj等通過增加來自交叉雜交物種的未標記DNA改進了DNA雜交技術來減少交叉反應。他們區(qū)分綿羊和山羊，約有10%的檢測極限。

　　5.2 聚合酶鏈反應（PCR）

　　PCR是一種生物體外的酶促合成特定DNA序列的方法。用于鑒別肉類的物種，PCR將線粒體DNA作為檢測的目標基因。選用線粒體DNA而不是基因組DNA作為肉類物種鑒定的目的基因是由于線粒體是從母體遺傳的，通常一個個體上只存在一個等位基因，因此不會產生由不止一個等位基因而導致的序列歧義的情況。線粒體基因的變量區(qū)域在每個細胞中都存在著成千上萬的副，這就增加了陽性結果的出現概率，即使是在由于劇烈的加工條件而使得DNA嚴重破碎的情況下也是如此。

　　由于PCR可以將特定的DNA序列，甚至單個細胞樣品中的單拷貝序列呈指數期的復制成多個副，因此PCR技術擁有高度的選擇性和靈敏度。PCR可以用于鑒定肉類品種的定性試驗。通過PCR可以鑒定近緣物種，甚至可以區(qū)別產自同一物種不同性別牲畜的生肉。

　　5.3 RAPD-PCR

　　RAPD-PCR（the random amplified polymorphicDNA-PCR）也稱作AP-PCR（arbitrary primer PCR）是一種用任意的隨機引物來檢測DNA序列圖譜的檢測方法。由RAPD-PCR得出的特殊且特定的模型可以用來區(qū)分肉類的物種。RAPD-PCR不僅擁有簡單、快速、重現性好、敏感度高、辨識性高等優(yōu)點，并且可以在單次的PCR反應中同時檢測多個物種的DNA。這種分析方法也適用于識別在不同的加工條件下的肉類和肉類產品的物種。

　　5.4 種特異性PCR

　　使用種特異性PCR（ species-specific PCR）鑒定肉和肉制品的物種比其他的PCR檢測方法更加的簡便、靈敏和快速。然而，單次PCR反應可檢測的物種數量卻被降低。這種PCR方法可以通過檢測目標DNA或線粒體DNA來鑒定肉的種類。豬的特異性DNA引物已被成功用來鑒定各種肉和肉產品，如生肉、熟肉、香腸、腌肉產品和漢堡包等[32]。種特異性PCR方法由于其操作簡單、高特異性和高靈敏度，是一個強大的牛肉鑒定手段，在加工和未加工的食物中皆適用。

　　線粒體DNA的12S rRNA，16S rRNA，d循環(huán)（D-loop）和細胞色素b區(qū)域（cytochrome b regions）

　　一般被用作目標物種鑒別的目標區(qū)域。通過使用設計在細胞色素b基因上的引物，種特異性PCR已成功應用于檢測和區(qū)分食品中的雞、火雞、豬、牛和羊的成分。

　　5.5 PCR-RFLP

　　PCR-RFLP技術（the restriction fragment lengthpolymorphis），即限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應技術，其基原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。此項技術大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。但這種技術較為復雜的，并需要相配的實驗室，嚴格的分析技術和昂貴的酶。然而，這種分析方法針對熟肉的鑒定有著較大的潛能。有試驗證明，PCR-RFLP可在肉類混合物中，鑒定出不到1%的水平的雞和火雞肉。同樣，羊肉和山羊肉也可通過使用ApaI限制酶的PCR-RFLP分析來區(qū)分。

　　針對線粒體DNA使用PCR-RFLP技術，可以鑒別經過鹵水、熱處理和發(fā)酵的近緣的肉制品，包括豬、牛、野豬、野牛、綿羊、山羊、馬、雞、火雞和野味等。然而，絕大多數的RFLP方法是適合用來定性檢測單一物種的肉，而混合物會產生復雜的指紋，并不容易解讀。

　　5.6 復合PCR

　　復合PCR技術（multiplex PCR）采用多對引物對目標基因與線粒體DNA進行測定，可以同步、準確和快速的在單次PCR反應中識別多個肉類品種。已有文獻表明，復合PCR可以用來識別雞肉、火雞肉、牛肉、豬肉、羊肉、羊肉、驢肉和馬肉，其對熟肉和加工肉類的檢出限為1%。Dalmasso使用設定在線粒體12s rRNA基因的正向引物和特異性反向引物鑒定鵝、土番鴨、雞、的火雞和豬。

　　另有試驗使用設定在5S rRNA基因正向引物和 特異性反向引物鑒定出混合在鵝肝中的鴨肝。

　　5.7 Real-Time PCR

　　常規(guī)的PCR技術雖然可以對不同物種的混合肉類進行定性檢測，但卻不能實現對產品中的物種進行定量。而Real-Time PCR（又稱實時定量熒光PCR）不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR是指在PCR指數擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。

　　有研究證實，通過對放大的線粒體12S rRNA基因、細胞色素b基因及16S rRNA基因進行Real-TimePCR試驗可以鑒別混合肉中肉的成分。而設計后的探針可以定量的分析馬肉、驢肉和豬肉的混合物，并且不局限于食物是否經過加工和現今實驗人員可以通過對DNA進行測序來鑒定已知序列的肉類物種。經過實驗人員的不斷測序分析，現今已有大量的常見動物物種、品種和基因變異的基因序列存于數據庫中，如美國國家生物技術信息中心的數據庫等。

　　只要物種擁有獨特的DNA序列，DNA測序都可以對其進行鑒定，就算是沒有任何參考資料的未知樣品也同樣可以進行鑒定。試驗方法為先通過PCR擴增來得到樣品的DNA序列，然后將其與數據庫中的大量已知物種信息進行比對，就可以得到樣品的物種。通過PCR擴增來識別 DNA序列是一種非常直接和有效的方式，通常會伴隨著凝膠電泳，并使用 Real-Time PCR對其結果進行定量分析。傳統的Sanger測序技術是通過雙脫氧鏈終止法對PCR反應完成時產物的長度進行的末端分析，得出模板鏈的堿基序列。然而由于Sanger測序法操作繁瑣、成較高，不能滿足大規(guī)模測序的需要。新一代的測序方法則以高通量、低成為主要特點，主要包括Illumina公司的Solexa測序技術、羅氏公司的454測序技術和ABI公司的SOLiD測序技術等，目前已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。

　　5.8 DNA條形碼（DNA barcode）

　　2003年，加拿大Guelph大學的生物學家Paul Hebert教授首次提出利用線粒體細胞色素C氧化酶1（cytochromeC oxidase 1）基因構建物種鑒別體系，而這段擁有648個堿基對的基因序列則被稱為DNA條形碼（通常被簡稱作CO1或COI），并期待像在零售業(yè)的發(fā)展過程中起到了舉足輕重作用的條形碼技術一樣，根據對1個統一的目標基因DNA序列的分析來完成物種鑒定的過程。

　　截止2011年已有112547種動物和近43 000植物、真菌和其他類型生物的DNA條形碼已存入數據庫中，并且這個數字還在不斷增加。DNA條形碼作為對地球上現有物種進行識別和鑒定的一項新技術， 受到國內外廣泛關注。

　　在美國，為規(guī)范魚類交易，避免以次充好，美國食品和藥物管理局2011年年底宣布它將擴大其使用DNA檢測在檢查海鮮制造商和餐館。

　　6 結論

　　現階段可用于確定 肉類品種的方法大致可以分為5種： 物理技術、化學技術、免疫學技術、電泳技術、以及DNA鑒定技術。這些檢測方法是基于肉類品種之間的解剖差異、化學分析、蛋白質或DNA鑒定而建立的。

　　物理和化學技術適合用于鑒定較為完整的生肉，并可以通過物理方法按照相應的標準對肉類的品質進行分級，并由于其操作簡便，較為適用于現場執(zhí)法工作。而碎肉、肉末以及僅經過適度加工的肉則適合采用免疫學和電泳方法，如SDS-PAGE、IEF和ELISA。

　　但是對于經過熱加工的肉類而言，由于熱加工會使肉類的蛋白質變性，因此基于DNA的檢測方法擁有著更高的可靠性，如傳統的DNA分析和實時PCR等。線粒體和基因組中的DNA均可以通過單拷貝和重復序列的方法PCR擴增序列，具體方法的選擇會極大程度的受到檢測極限的影響。如果需要定量的鑒定肉的種類，則需要選用基于實時PCR分析方法。最新的DNA條形碼技術正受到國內外廣泛關注，目前已越來越多的在肉類物種的鑒定和執(zhí)法工作中采用。