摘要：肉類調理食品方便快捷，營養(yǎng)美味，深受消費者青睞，但其豐富的營養(yǎng)物質容易造成微生物的滋生，影響食品品質和消費者健康。高通量測序技術可以全面、準確的研究肉類調理食品中微生物群落結構，為微生物防控和標準化生產提供理論基礎。本文通過均質提取法對肉類調理食品中微生物基因組進行提取，并以16S rRNA可變區(qū)V3-V4作為測序片段，分析細菌多樣性。實驗表明，4種肉類調理食品細菌多樣性均較高，菌群結構具有一定的相似性，炸雞塊、骨肉相連和冷凍牛排的優(yōu)勢菌群是Anderseniella屬，而羊肉串優(yōu)勢菌群是不動桿菌屬，此外肉類調理食品中還存在芽胞桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬和乳球菌屬等。本論文明確了使用均質提取法對肉類調理食品中微生物進行16S rRNA V3-V4區(qū)測序分析，為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。

　　關鍵詞：肉類調理食品；細菌多樣性；高通量測序；16S rRNA

　　肉類調理食品一般是指以畜和禽肉為主要原料，經適當加工，在冷凍或冷藏條件下貯存、流通和售賣，可直接食用或簡單加工后食用的肉類制品，包括炸雞塊、烤翅、羊肉串、肉丸、煙熏火腿和冷凍牛排等。肉類調理食品營養(yǎng)豐富，且由于加工過程中殺菌不徹底，以及我國冷鏈設備不完善，容易滋生微生物。因此，開展肉類調理食品菌群結構研究，分析微生物多樣性，有利于抑制致病菌和腐敗菌的產生，對肉類調理食品的質量控制和標準化生產具有一定的指導意義。

　　在菌群結構的分析檢測方面，分子生物學技術，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)等，相對于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，操作簡單，準確度高，但是無法檢測樣本中低豐度的物種。近年來，新興的高通量測序技術可以進行大規(guī)模平行測序，能夠客觀反映樣本中低豐度和不可培養(yǎng)的細菌，逐漸發(fā)展為菌群結構研究的主流技術，廣泛應用于醫(yī)藥、環(huán)境、食品等各個領域。Abdul-Mutalib等利用焦磷酸測序研究了不同衛(wèi)生等級餐廳案板上微生物菌群分布情況，發(fā)現(xiàn)案板上的菌群多樣性較高，且微生物數(shù)量與餐廳衛(wèi)生等級無關，不同衛(wèi)生等級的餐廳均存在一定的安全隱患。

　　二代測序以454和Illumina平臺應用最為廣泛，菌群分析的測序基因主要是16S rRNA的9個可變區(qū)，不同可變區(qū)對于不同菌屬細菌的分辨能力不同，根據研究需要和測序平臺選擇合適的測序片段，菌群分析相關文獻中涉及到的基因片段包括一個可變區(qū)（V3、V4和V6）、兩個可變區(qū)（V1-V2、V3-V4和V4-V5）或三個可變區(qū)（V1-V3、V3-V5和V4-V6）等，但目前還沒有統(tǒng)一的測序標準。

　　為了研究肉類調理食品中細菌多樣性，本文采用均質提取法對樣本中微生物基因組進行提取，利用Illumina MiSeq測序平臺完成微生物16S rRNA可變區(qū)V3-V4測序，分析肉類調理食品菌群結構，對產品工藝改進和微生物控制提供基礎數(shù)據。此外，本文明確了使用均質提取法和16S rRNA V3-V4區(qū)測序分析肉類調理食品中微生物多樣性，為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。

　　炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排購于北京市某大型超市，樣品均為普通袋裝，執(zhí)行速凍調理食品行業(yè)標準SB/T 10379-2012，購買后按照產品貯存條件（-18℃以下）進行冷凍保存，在保質期內對樣本進行檢測。樣本信息見表1。

　　拍打式均質機；恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；高速冷凍離心機；小型臺式離心機；PCR擴增儀；電泳儀；凝膠成像儀。

　　1.3.1  樣本前處理

　　以無菌操作取樣品25g，充分剪碎后，加入到含有225mL生理鹽水的均質袋中，使用拍擊式均質器均質1min，獲得樣品勻液。吸取上清30mL、2000r/min離心10min，沉淀食品雜質；吸取上清液20mL，10000r/min離心3min，緩慢倒掉上清液，獲得菌體沉淀。每個樣本均設置2個平行，炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排樣本編號分別為 J-JK、J-YR、J-GR和J-NP。

　　1.3.2  基因組DNA提取

　　使用QIAamp DNA Stool Mini Kit ，根據試劑盒說明書提取菌體沉淀基因組DNA。提取后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

　　1.3.3  高通量測序

　　提取的基因組DNA 送至生工生物工程（上海）有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。首先使用細菌的通用引物341F（barcode-CCTACGGGNGGCW GCAG）和805R（barcode-GACTACHVGGGTATCTA ATCC）擴增16S rRNA 基因V3-V4區(qū)，第二輪擴增引入 Illumina 橋式擴增引物，并利用膠回收純化擴增產物，經Qubit 2.0精確定量后上機測序。

　　1.3.4  數(shù)據分析

　　通過Barcode區(qū)分樣本，并使用FLASH軟件將雙端測序序列拼接成單條序列。利用Prinseq過濾低質量的序列，完成質量控制。隨后使用Mothur軟件對序列進行測序錯誤校正，并采用chimeras.uchime去除序列中的嵌合體，獲得優(yōu)化序列?；谏鲜鰞?yōu)化序列，利用Uclust軟件聚類，以序列之間的相似性（0.97作為閾值，分成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OUT），并采用RDP classifier完成物種分類。最后使用R軟件進行α多樣性指數(shù)的計算，繪制菌群豐度圖和樣本聚類圖。

　　本研究使用二代測序技術對微生物16S rRNA V3-V4區(qū)進行擴增，測序平均序列讀長459 bp，優(yōu)化后序列平均讀長為420bp，通過對序列進行歸類操作，按照序列間的距離進行聚類， 以0.97作為序列相似性 閾值劃分操作分類單元 （OTU）。 本次實驗將所有OTU比對到SILVA數(shù)據庫，共得到28個門、57個綱、107個目和229個科共783個屬，其中包括62個無法鑒定的屬。各樣本的原始序列數(shù)、優(yōu)化序列數(shù)和 OTU 數(shù)及在門和屬水平對應的細菌數(shù)見表 2。由表2可知，測序數(shù)據量基本滿足分析需求，4 種肉類調理食品中微生物種類很多，平均每個樣本中存在三百余種細菌。

　　Nam等對發(fā)酵食品中微生物V1-V2區(qū)進行測序分析，樣本序列數(shù)在18000～25000之間，OTU數(shù)在700～1100之間，本研究獲得的序列數(shù)和OTU數(shù)分別在11000～22000和2300～3500之間，樣本中細菌菌屬在285～347之間，說明實驗采用的V3～V4區(qū)可以較好地鑒定各類細菌，基本滿足物種在屬水平上的比較分析。而利用PCR-DGGE技術檢測骨肉相連，僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬等7個優(yōu)勢菌屬，與本實驗檢出的300余種菌相比，PCR-DGGE技術無法客觀反應低豐度物種，容易對微生物物種組成和豐度做出片面的判斷。

　　2.2  α多樣性指數(shù)

　　α多樣性指某個生境內的多樣性，是評價生境內部物種多樣性的指標。α多樣性主要關注兩方面信息，一是群落所含物種種類的多少，即物種豐富度，用Chao1 Index和ACE Index計算；二是群落中各物種的相對數(shù)量，即物種均勻度，既考察物種多樣性，又考察種的多度， 由Shannon Index和Simpson Index反映。表3顯示的是各樣本α多樣性指數(shù)，由表3可知，各樣本菌群豐度很高，菌群多樣性也較高。測序深度指數(shù)（Coverage）是指各樣品文庫的覆蓋率，數(shù)值越高，越能反應樣本的真實情況，本次實驗覆蓋率在0.87～0.91之間，基本可以涵蓋樣本中大多數(shù)菌群，測序數(shù)據量滿足分析的需要。

　　2.3  肉類調理食品細菌多樣性

　　實驗樣本購買于同一超市，均貯藏于-18℃以下冷凍條件下，但是不同樣本的肉類品種來源、加工工藝與生產環(huán)境存在差異，因此，各樣本之間的主要細菌類群、菌群比例也會存在一定的差異。

　　在門分類水平上，4 種肉類調理食品中微生物主要是變形菌門和厚壁菌門，這兩類細菌占總菌數(shù)的80%～90%左右，此外還存在少量的擬桿菌門和放線菌門等。在屬水平上，4種肉類調理食品表現(xiàn)出一定的差異，圖1顯示了各樣本屬水平物種豐度較高的前20個序列信息。其中，炸雞塊中優(yōu)勢菌群是Anderseniella屬（占總序列數(shù)的45.21%），此外占總序列數(shù)2%以上的還包括乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及未分類的菌屬等；羊肉串優(yōu)勢菌群是不動桿菌屬（Acinetobacter，占總序列數(shù)的26.90%），還存在Anderseniella屬、梭菌屬(Clostridium)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及泛菌屬 (Pantoea) 等；骨肉相連優(yōu)勢菌群是Anderseniella 屬（占總序列數(shù)的25.32%），此外還存在泛菌屬(Pantoea)、梭菌屬(Clostridium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、香味菌屬(Myroides)以及腸桿菌屬(Enterobacter)等；冷凍牛排優(yōu)勢菌群是Anderseniella 屬（占總序列數(shù)的28.49%），此外還存在漫游球菌屬(Vagococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、鏈球菌屬(Streptococcus)、魏斯氏菌屬(Weissel la)以及梭菌屬(Clostridium)等。

　　本實驗在肉類調理食品中檢出Anderseniella的存在，且占據較大比例。Anderseniella是革蘭氏陰性菌，異養(yǎng)需氧型，屬于變形菌門、α變形菌綱、根瘤菌目、紅菌科，與紅菌屬(Rhodobium)相似度很高，Anderseniella目前僅包含Anderseniella baltica一個種，曾從波羅的海缺氧表沉積物中分離出來，可以在鹽度0.8%～6%之間生長。有關Anderseniella的研究文獻較少，目前還沒有文獻顯示Anderseniella在肉類食品中檢測或者分離出來。而本實驗使用二代測序技術檢出Anderseniella在肉類調理食品中存在，這可能與食品的生產工藝有關。炸雞塊、羊肉串、骨肉相連和冷凍牛排生產工藝流程有一定的相似性，將肉類原料預處理（清洗并切塊等）后，再加入食鹽等調味料腌制一定的時間，熟制或不經過熟制后，真空包裝、冷凍保藏。由于調理食品需要進行腌制，腌制過程中高鹽度對微生物進行了選擇和富集，4種肉類調理食品營養(yǎng)成分表顯示，鈉含量在4.81mg/g～14mg/g之間，若鈉均以氯化鈉形式存在，那么換算成鹽度，4種食品鹽度介于1.22%～3.56%之間，適于Anderseniella的生長，而對其他菌屬具有抑制作用，因此腌制過程結束后Anderseniella可能大量存在于食品中。
 

 

　　雖然肉類調理食品種類不同，但菌群結構存在一定的相似性。在物種豐度較高的前20 個序列中，Anderseniella屬、不動桿菌屬、芽胞桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬是4種肉類調理食品中的共有菌群，乳球菌屬、嗜冷桿菌屬、乳桿菌屬、香味菌屬、漫游球菌屬、沙雷氏菌屬和泛菌屬等也廣泛存在于肉類調理食品中。除了Anderseniella，其他菌屬在肉及肉制品中常有檢出。其中革蘭氏陽性菌有乳球菌屬、乳桿菌屬、芽胞桿菌屬、梭菌屬和漫游球菌屬；革蘭氏陰性菌有Anderseniella、假單胞菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、泛菌屬、香味菌屬和沙雷氏菌屬。乳球菌屬和乳桿菌屬是乳品發(fā)酵中有益微生物，常用于干酪和酸牛乳的生產；芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬和不動桿菌屬廣泛存在于自然界，部分菌種是食品腐敗菌或人致病菌，如蠟樣芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、粘質雷氏菌和鮑曼不動桿菌等。

　　肉類調理食品中細菌種類較多，除了來源于動物腸道，還可能來源于動物屠宰、食品加工和包裝等每一個生產環(huán)節(jié)，肉及肉制品所接觸的外界環(huán)境、加工用具、包裝材料和人員等均會造成微生物污染，肉制品之間也存在交叉污染。因此，各食品企業(yè)需要加強 對原料肉的檢測，實施規(guī)范化生產、標準化管理，重點對動物屠宰、切割及修整過程微生物污染進行監(jiān)管和控制，保證產品質量。此外，很多肉類調理食品在流通和貯藏過程中需要冷藏或冷凍保存，而我國冷鏈系統(tǒng)尚不完備，溫度的波動也為微生物的生長繁殖提供條件。

　　值得關注的是，肉類調理食品中的優(yōu)勢菌群并不是嗜冷菌，這與我們實驗前的理論推測是不同的。實驗結果表明，盡管樣本的貯存條件是-18℃，但仍然存在生長溫度在30℃～37℃的中溫菌，如不動桿菌屬、梭菌屬、泛菌屬和明串珠菌屬等。這些菌屬很可能處于“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state，VBNC)”，即喪失細菌可培養(yǎng)的特征，但是細胞膜完整，有一定的代謝活力，遇到適宜條件，可恢復到可培養(yǎng)的狀態(tài)，這是某些無法產生芽胞的細菌對抗環(huán)境壓力的一種反應。研究表明，溫度是誘導細菌進入VBNC狀態(tài)最主要的原因，因此肉類調理食品在冷凍處理時，埃希氏菌屬、志賀氏菌、腸球菌和弧菌等很可能進入VBNC狀態(tài)，一旦遇到適宜的生長條件，便會再次復蘇，對消費者的身體健康造成危害。

　　維恩圖可在OTU水平對4種肉類調理食品中菌群進行分析，圖2直觀的反映了樣本間的共有OTU和特有OTU。為了清楚顯示，本實驗將2個平行樣本合并分析（J-JK1和J-JK2合并為J-JK，其他樣本類同），J-JK、J-YR、J-GR和J-NP獲得的OTU數(shù)分別為3486、5014、5122和3773，所有樣本共含有12000余種不同的OTU。由圖可知，每2種實驗樣本之間相同的OTU數(shù)在1019～1902之間，4種樣本之間相同的OTU數(shù)為502個，占總OTU數(shù)的4.16%。

　　為了從微生物種類和豐度層面研究4種肉類調理食品的異同，本研究基于Bray-Curtis指數(shù)繪制樣本聚類圖，如圖3所示，菌群組成相似度越高的樣本在圖中的距離越小。整體而言，4 種肉類調理食品之間具有很大的相似性，其中，炸雞塊和牛排、羊肉串和骨肉相連相似度較高，分別聚為一簇。而同為雞肉制品的炸雞塊和骨肉相連并未表現(xiàn)出明顯的相似性，這可能是二者加工工藝、加工環(huán)境不同引起的。此外，在樣品中檢測出了不可分類微生物，如unclassified Rhodobacteraceae和unclassified Anaerolineaceae等，這是由于測序結果與數(shù)據庫中序列不匹配或相似度不夠閾值，因此這些序列被歸為不可分類的微生物。

圖3 各樣本在屬水平聚類圖

　　利用高通量測序技術可以直接從食品中提取微生物基因組，對不可培養(yǎng)細菌和低豐度細菌也可有效檢測，能夠客觀分析食品中菌群結構，且高通量測序技術可以對多個樣本同時檢測，相對于傳統(tǒng)方法能夠迅速、高效的完成樣本菌群分析。本論文明確了使用均質提取法提取微生物基因組，并采用二代測序技術進行16S rRNA V3-V4區(qū)測序，為后續(xù)大規(guī)模菌群研究提供思路和方法。實驗結果表明，肉類調理食品中細菌多樣性高，4種肉類調理食品菌群結構具有一定的相似性，在門分類水平，主要是變形菌門和厚壁菌門組成；在屬水平，Anderseniella 屬、不動桿菌屬、芽胞桿菌屬、嗜冷桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬等廣泛存在，這些微生物可能來源于動物腸道、動物屠宰、食品加工和包裝等加工工序，因此，各食品企業(yè)需要優(yōu)化生產工藝，加強生產管理，制定標準化操作流程，保證產品質量穩(wěn)定。