摘 要：為研究低壓靜電場結(jié)合高濕解凍對羊肉保水性的影響，以宰后成熟24h羊后腿肉為原料，將其置于-18℃冰箱中冷凍24h后解凍，對比分析低壓靜電場結(jié)合高濕解凍（電流0.2mA、電壓2 500V、4℃、相對濕度98%）與其他3種解凍方式冰箱解凍（4℃、相對濕度55%）、低壓靜電場輔助解凍（電流0.2mA、電壓2 500V、4℃、相對濕度55%）、高濕解凍（4℃、相對濕度98%）對羊肉解凍速率、保水性、水分分布、羰基含量、總巰基含量、溶解度、表面疏水性，蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：4種解凍方式中，低壓靜電場結(jié)合高濕解凍解凍時(shí)間（519min）最短，解凍損失率（3.37%）、蒸煮損失率（30.60%）、羰基含量（3.85nmol/mg）、表面疏水性（21.90μg）最低，不易流動(dòng)水相對含量（97.96%）與新鮮肉（98.44%）最接近，總巰基含量（28.55nmol/mg）及溶解度（29.98%）最高，且蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，說明低壓靜電場結(jié)合高濕解凍不僅能夠縮短解凍時(shí)間、有效抑制蛋白質(zhì)氧化變性、減少汁液流失，且經(jīng)過該處理的羊肉蛋白水合能力最高，保水性最好。
 

　　關(guān)鍵詞：羊肉；保水性；低壓靜電場；高濕解凍
 

　　冷凍作為肉及肉制品貯藏流通時(shí)的一種手段，能夠有效抑制肉中微生物生長，延緩生物化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而延長保質(zhì)期。而肉及肉制品經(jīng)過冷凍后再進(jìn)一步加工前需要進(jìn)行解凍處理，但解凍過程伴隨著物理、化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致色澤、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等肉品質(zhì)劣變，尤其是解凍后的汁液流失最為嚴(yán)重，肉中的蛋白質(zhì)會(huì)隨著解凍汁液流出，不僅造成質(zhì)量損失，而且造成營養(yǎng)損失，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。因此冷凍肉的品質(zhì)不僅取決于冷凍過程還取決于解凍的過程。而選擇合適的解凍方式對于維持肉品品質(zhì)顯得尤為重要。目前傳統(tǒng)解凍方式如空氣解凍、靜水解凍、冷藏解凍等，耗時(shí)長，解凍后肉品品質(zhì)劣變嚴(yán)重，新型解凍方式如微波解凍、超聲波解凍、高壓靜電場解等，解凍效率高，能夠有效縮短解凍時(shí)間，但存在一定局限性。如微波解凍會(huì)導(dǎo)致局部過熱且蛋白質(zhì)易于變性；而超聲波解凍穿透力差、能耗高；高壓靜電場解凍則能耗高，且電壓過高，存在安全隱患。
 

　　近年來，低壓靜電場輔助解凍由于其安全、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)得到廣泛關(guān)注。Qian Shuyi等研究了低壓靜電場輔助解凍對牛肉品質(zhì)的影響，結(jié)果表明低壓靜電場輔助解凍能夠縮短解凍時(shí)間，維持牛肉品質(zhì)。低溫高濕解凍效率高、成本低、適用性強(qiáng)，也備受人們的關(guān)注。有研究表明高濕解凍能夠減少水分流失，并在肉樣表面形成水化膜隔絕氧氣抑制蛋白氧化。而解凍過程中肌原纖維蛋白氧化則是汁液流失的重要誘因之一。因此選擇適宜的解凍方式有利于效縮短解凍時(shí)間，抑制蛋白氧化，減少汁液流失，降低解凍成本。而目前國內(nèi)外對于低壓靜電場結(jié)合高濕解凍對羊肉保水性的研究鮮有報(bào)道，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)低壓靜電場結(jié)合高濕解凍可以有效提高解凍效率，維持肌肉色澤。但對于該解凍條件下羊肉保水性變化機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以新鮮羊肉作為對照，對比分析了低壓靜電場結(jié)合高濕解凍（4℃，相對濕度為98%）與其他3種解凍方式傳統(tǒng)低溫解凍（4℃，相對濕度為55%）、高濕解凍（4℃，相對濕度為98%）、低壓靜電場輔助解凍（4℃，相對濕度為55%）對冷凍羊肉解凍時(shí)間、保水性、蛋白質(zhì)氧化及蛋白構(gòu)象的影響，為新解凍方式在冷凍羊肉中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
 

　　1 材料與方法
 

　　1.1 材料與試劑

　　原料肉購自北京北農(nóng)市場。選取5只6月齡、體質(zhì)量約60kg唐縣育肥帶尾羊。羊經(jīng)放血后采用立式屠宰法進(jìn)行屠宰，屠宰后于4℃成熟24h，分割完成取5只羊右后腿置于采樣箱中冰袋包裹2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

　　牛血清白蛋白；氯化鈉、磷酸鈉、氯化鎂、氫氧化鈉、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）；乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol bis（2-aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA）、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、溴酚藍(lán)；所有試劑均為分析純。
 

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　YC-520L冰箱；DENBAs鮮度保持電場裝置；L93-4溫度記錄儀；NK5500濕度

　　記錄儀；MesoMR23-060H-I低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LFNMR）儀；X-12離心機(jī)；TM-18 Basic勻漿機(jī)；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀；F-2500熒光分光光度計(jì)、U-3010紫外-可見分光光度計(jì)。
 

　　1.3 方法

　　1.3.1 原料肉的處理

　　于室溫下剔除肉樣表面可見脂肪和結(jié)締組織，分割成約5cm×4cm×2cm、質(zhì)量（53±5）g的肉塊，共50塊。從分割好的后腿肉中隨機(jī)取出10塊作為一組裝入自封袋中，共分為5組，分別為鮮肉（fresh meat，F(xiàn)M）、冰箱解凍組（refrigerator thawing，RT）（4℃、相對濕度55%），低壓靜電場輔助解凍組（low voltage electrostatic field assisted thawing，LT）（4℃、相對濕度55%）、高濕解凍組（high humidity thawing，HT）（4℃、相對濕度98%）及低壓靜電場結(jié)合高濕解凍組（low voltage electrostatic field combined with high humidity thawing，LHT）（4℃、相對濕度98%）。將4組肉樣置于-18℃冰箱中冷凍24h后解凍，以肉樣中心溫度達(dá)到4℃為解凍終點(diǎn)，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定。

圖1 低壓靜電場結(jié)合高濕解凍裝置示意圖
 

　　1.3.2 低壓靜電場和高濕解凍處理

　　低壓靜電場裝置由連接靜電板（14cm×12cm）的電源和變壓器（最大輸出電壓為2 500V、最大電流0.2mA）組成（圖1）。高濕盒由一個(gè)可密封的聚丙烯盒子（24cm×16cm×10cm）和2塊聚乙烯醇（poly vinyl alcohol，PVA）海綿（11cm×7cm×3cm）組成，2塊海綿均吸收45mL蒸餾水后置于高濕盒兩側(cè)，并將未吸水海綿同樣置于聚丙烯盒兩側(cè)作為低濕盒。所有解凍實(shí)驗(yàn)均在4℃冰箱中進(jìn)行，每個(gè)處理2個(gè)解凍盒，每個(gè)盒中放置5塊肉樣。RT組和LT組肉樣均放于低濕盒中加蓋密封解凍，并將LT組放在靜電板上；HT組和LHT組肉樣均放于高濕盒中加蓋密封解凍，并將LHT組放在靜電板上。

　　1.3.3 解凍時(shí)間的測定

　　設(shè)定溫度記錄儀參數(shù)，每隔1min測定一次，在肉樣冷凍前將溫度記錄儀插入肉樣中心部位，解凍時(shí)開啟溫度記錄儀，解凍完成用LOGGER 1.8.2軟件獲取數(shù)據(jù)，繪制溫度變化曲線。

　　1.3.4 解凍損失率的測定

　　分別稱取貯藏前肉樣質(zhì)量（m0/g）、解凍后肉樣質(zhì)量（m1/g），稱質(zhì)量前先用吸水紙擦干肉樣表面水分。解凍損失率按式（1）計(jì)算。

　　1.3.5 蒸煮損失率的測定

　　將解凍后的肉樣修剪成約4cm×3cm×2cm大小，在72℃水浴鍋中蒸煮30min，隨后冷水冷卻至室溫。分別稱取蒸煮前質(zhì)量（m2/g）和蒸煮后質(zhì)量（m3/g）。蒸煮損失率按照公式（2）計(jì)算。

　　1.3.6 離心損失率的測定

　　將解凍后肉樣切成約2.7g大小，用濾紙包裹置于10mL離心管中，在4℃條件下2 000×g離心15min。分別稱取離心前質(zhì)量（m4/g）和離心后質(zhì)量（m5/g）。離心損失率按照式（3）計(jì)算。

　　1.3.7 水分分布和氫質(zhì)子成像分析

　　水分分布和氫質(zhì)子密度成像參照謝小雷等的方法稍作修改。將解凍后的肉樣品切成4cm×3cm×2cm的肉塊，設(shè)置核磁共振的參數(shù)：主頻為23MHz、偏移頻率為286.781 3kHz、90°脈沖時(shí)間為17μs、180°脈沖時(shí)間為35μs、采樣點(diǎn)數(shù)54 996、重復(fù)時(shí)間3 000ms、累加次數(shù)4次、回波數(shù)2 000。將樣品放入直徑為60mm的檢測管中，采用核磁共振成像系統(tǒng)自旋回波成像序列對肉樣進(jìn)行氫質(zhì)子密度成像測定，參數(shù)設(shè)置為：重復(fù)時(shí)間2 000ms、重復(fù)次數(shù)4次、縱向弛豫時(shí)間20ms，根據(jù)CPMG序列測得的弛豫時(shí)間T2，選擇自旋回波時(shí)間20ms。

　　1.3.8 羊肉肌原纖維蛋白的提取

　　參考Li Yin等的方法進(jìn)行肉樣肌原纖維蛋白的提取，提取的肌原纖維蛋白置于4℃冰箱內(nèi)備用。雙縮脲法進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度的測定，并用磷酸鹽緩沖液（20mmol/L Na2HPO4、0.6mol/L NaCl，pH6.0，下同）稀釋蛋白。

　　1.3.9 蛋白質(zhì)羰基和總巰基含量測定

　　參考Zhang Bin等等的方法測定羰基含量。各取2份1mL 2mg/mL的肌原纖維蛋白溶液置于10mL離心管中，一份加入lmL 10mmol/L DNPH；另一份加入1mL2mol/L HCl溶液作為對照組。在室溫下避光靜置1h，期間每隔15min振搖一次，振搖1min。隨后加入1mL20g/100mL 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀蛋白15min，并在4℃下10 000×g離心5min，棄去上清液，隨后用1mL體積比為1∶1的乙酸乙酯-乙醇溶液充分洗滌重復(fù)3次。所得沉淀用3mL 6mol/L鹽酸胍溶液溶解，37℃條件下水浴保溫15min。隨后10 000×g離心5min，取上清液在370nm波長處測定吸光度。蛋白質(zhì)羰基含量按公式（4）計(jì)算。

　　式中：ρ為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度（2mg/mL）。

　　總巰基含量的測定參照Cui Chun等的方法。取1mL 2mg/mL肌原纖維蛋白溶液與8mL的Tris-甘氨酸緩沖液（0.086mol/L Tris、0.09mol/L甘氨酸、4mmol/LEDTA、8mol/L尿素，pH8.00）混勻，10 000×g離心15min。然后取4.5mL上清液，加入0.5mL 10mmol/LDTNB溶液，渦旋30s，室溫（25±1）℃下靜置30min，使用酶標(biāo)儀于412nm波長處測吸光度。以4.5mL Tris-甘氨酸緩沖液代替上清液作為空白對照，總巰基含量按照公式（5）計(jì)算。

　　式中：ε表示摩爾吸光系數(shù)（1.36×104L/（mol·cm）；D為稀釋倍數(shù)（10）；ρ為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度（2mg/mL）。

　　1.3.10 溶解度和表面疏水性的測定

　　取5mL 2mg/mL的肌原纖維蛋白溶液于10mL離心管中，在4℃條件下10 000×g離心15min，用雙縮脲法測定上清液蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)溶解度根據(jù)公式（6）計(jì)算。

　　肌原纖維蛋白表面疏水性的測定參考Chelh等的方法。取1mL2mg/mL肌原纖維蛋白溶液與200μL 1mg/mL的溴酚藍(lán)溶液混合均勻。對照組采用1 mL磷酸鹽緩沖液（不加蛋白）與溴酚藍(lán)溶液混合。將混合液在室溫下振蕩15min，隨后室溫下4 000×g離心15min。上清液用蒸餾水稀釋10倍，以磷酸鹽緩沖液為空白，在595nm波長處測定上清液光密度值（OD）。用結(jié)合態(tài)的疏水溴酚藍(lán)結(jié)合量（總溴酚藍(lán)與游離溴酚藍(lán)的差值）表征表面疏水性指數(shù)，蛋白質(zhì)表面疏水性根據(jù)公式（7）計(jì)算。

　　1.3.11 傅里葉變換紅外光譜測定

　　參照Gangidi等的方法略作修改。采用傅里葉變換紅光譜儀分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成，取20μL（2mg/mL）肌原纖維蛋白溶液置于衰減全反射（attenuated totalreflectance，ATR）-FTIR附件上掃描。測定條件：光譜掃描范圍為4 000～600cm-1，分辨率為4cm-1，信號掃描累加64次，掃描速率為0.63cm/s，每種處理圖譜掃描重復(fù)3次。采用Peakfit 4.12軟件分析1 600～1 700cm-1波段的峰，利用二階求導(dǎo)和去卷曲對酰胺Ⅰ帶進(jìn)行分峰處理，再結(jié)合曲線擬合的方法對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。

　　1.3.12 內(nèi)源熒光光譜測定

　　參考Wang Zhaoming等的方法略作修改。用F-2500熒光分光光度計(jì)測定肌原纖維蛋白溶液（0.5mg/mL）的色氨酸熒光光譜。參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長295nm狹縫寬度均為10nm、發(fā)射光譜范圍300～400nm。并以磷酸鹽緩沖液（20mmol/L Na2HPO4、0.6mol/L NaCl，pH6.0）作為空白對照進(jìn)行測定。

　　1.3.13 紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜測定

　　參考Wang Zhaoming等的方法并略作修改。肌原纖維蛋白溶液稀釋至0.5mg/mL，用稀釋液作為空白，置于U-3010紫外-可見分光光度計(jì)中測定紫外吸收光譜，波長掃描范圍為230～320nm，掃描速率為240nm/min。
 

　　1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行方差分析，并使用Duncan法多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。采用Origin 2021軟件繪圖，結(jié)果以3次平行測定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
 

　　2 結(jié)果與分析
 

　　2.1 不同解凍方式對冷凍羊肉解凍時(shí)間的影響

　　解凍過程伴隨著物理化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致肉品品質(zhì)劣變，因此解凍時(shí)間對肉及肉制品品質(zhì)具有重要影響。不同解凍方式下冷凍羊肉中心溫度變化如圖2所示。RT、LT、HT、LHT解凍時(shí)間分別為1 329、803、799、519min，LHT組解凍時(shí)間最短，RT組解凍時(shí)間最長，表明低壓靜電場與高濕解凍相結(jié)合能夠有效縮短解凍時(shí)間。4種解凍處理組中靜電場解凍組LT和LHT組分別比非靜電場解凍組RT和HT組解凍時(shí)間縮短。這與Qian Shuyi等研究結(jié)果相似，靜電場解凍時(shí)間較短可能是因?yàn)殡妶龃嬖谙码姌O周圍產(chǎn)生的離子被加速，由此產(chǎn)生的動(dòng)量從空氣中的離子轉(zhuǎn)移到中性空氣分子中，并形成電暈風(fēng)，而分散的流體被轉(zhuǎn)移到表面，在邊界層上形成湍流，增加了傳熱系數(shù)。而高濕解凍組HT和LHT組則分別比非高濕解凍組RT和LT組解凍時(shí)間短，這可能是因?yàn)楦邼駰l件下水蒸氣冷凝釋放大量潛熱，并在肉樣表面形成一層水化膜，傳熱速率提升。朱明明等也研究了不同高濕解凍條件下解凍對豬肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)境相對濕度的增加，解凍時(shí)間縮短，解凍效率提高。

　　2.2 不同解凍方式對羊肉持水性的影響

　　持水性是肉品最重要的品質(zhì)特性之一，較差的持水性不僅會(huì)導(dǎo)致較高的汁液流失，還伴隨著大量的肌漿蛋白和其他水溶性營養(yǎng)物質(zhì)流失，最終導(dǎo)致肉品營養(yǎng)價(jià)值下降。而解凍損失率、蒸煮損失率、離心損失率等常用來表征肉品持水性高低。不同解凍方式對羊肉的持水性影響如表1所示。LT、HT和LHT組解凍損失率分別為3.73%、4.90%和3.37%，顯著低于RT組（6.71%）（P＜0.05）?？赡苁且?yàn)镽T的解凍時(shí)間過長，蛋白質(zhì)氧化嚴(yán)重，氧化使得蛋白質(zhì)去折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白水結(jié)合能力降低。LHT組解凍損失率最低，且顯著低于HT組（P＜0.05）?？赡苁窃诟邼癍h(huán)境下肉樣表面形成的水膜維持了肌細(xì)胞的完整性和保水性，同時(shí)低壓靜電場輔助解凍有效減少了肌肉水分流失，改善了羊肉品質(zhì)。

注：同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。
 

　　不同解凍方式也會(huì)造成肉樣蒸煮損失、離心損失發(fā)生不同程度變化。經(jīng)過解凍后的肉樣蒸煮損失率和離心損失率較新鮮肉總體顯著增加（P＜0.05），各解凍組間蒸煮損失率和離心損失率無顯著差異（P＞0.05）。其中，LHT組蒸煮損失率和離心損失率均最低，分別為30.60%、14.17%，且離心損失率與鮮肉（13.36%）差異不顯著（P＞0.05），這與解凍損失率結(jié)果相一致。表明低壓靜電場結(jié)合高濕解凍有效提高解凍后肉樣的保水能力。
 

　　2.3 不同解凍方式對羊肉T2弛豫時(shí)間、水分分布和氫質(zhì)子密度的影響

　　通過LF-NMR測定的T2可反映肉樣中水分的遷移和流動(dòng)性。圖3A中可觀察到代表3種不同水分的峰，分別是弛豫時(shí)間為0.1～10ms的結(jié)合水（T2b）、10～100ms處分布在肌纖維網(wǎng)中的不易流動(dòng)水（T21）和100～1 000ms處的自由水（T22）。各組T2b沒有明顯差異，而不同解凍方式下T21延長，表明經(jīng)過解凍可能會(huì)使得水分流動(dòng)性增強(qiáng)。圖3B為不同解凍方式下肉樣中結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水相對相對含量圖。解凍后結(jié)合水相對含量上升，且LHT組結(jié)合水相對含量最低，RT組結(jié)合水相對含量最高，這可能是因?yàn)橹皟鼋Y(jié)過程中形成的冰晶在一定程度上破壞了肌肉組織結(jié)構(gòu)。就不易流動(dòng)水而言，鮮肉相對含量最高（98.44%），而解凍后不易流動(dòng)水相對含量下降，其中相較于其他解凍組，LHT組相對含量最高（97.96%），另外，觀察到解凍后自由水相對含量上升，表明解凍后水分發(fā)生遷移，部分不易流動(dòng)水態(tài)變?yōu)樽杂伤?，且自由水含量越高表明肉樣保水性越差。Cao Minjie等也報(bào)道了類似的結(jié)果。這可能是因?yàn)槿鈽咏鈨鲞^程中蛋白質(zhì)氧化造成蛋白質(zhì)去折疊，蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水性氨基酸暴露，表面疏水性上升，蛋白與水結(jié)合能力下降，冰晶融化后的部分不易流動(dòng)水無法再與變性蛋白結(jié)合而發(fā)生遷移流到細(xì)胞外，轉(zhuǎn)變?yōu)榱俗杂伤?。而RT組不易流動(dòng)水相對含量最低、自由水相對含量最高，而LHT組則正相反，這也與保水性結(jié)果一致。

圖3 不同解凍方式對羊肉弛豫時(shí)間（A）、水分分布（B）和氫質(zhì)子成像（C）的影響
 

　　氫質(zhì)子密度可用來反映肉樣的含水率。圖像越紅則代表氫質(zhì)子密度越高，含水率也越高，圖像越藍(lán)則表示氫質(zhì)子密度越低，含水率越低。不同解凍方式下氫質(zhì)子密度如圖3C所示，鮮肉圖像大部分為紅色，表明含水率高。RT組解凍后紅色少，含水率低。而LHT組解凍紅色區(qū)域較多含水率高。這與持水性分析結(jié)果一致。
 

　　2.4 不同解凍方式對羊肉羰基含量、總巰基含量、溶解度及溴酚藍(lán)結(jié)合量的影響

　　蛋白質(zhì)羰基衍生物含量是衡量蛋白質(zhì)氧化程度的最常用指標(biāo)之一，羰基含量越高則表明蛋白氧化程度越高。不同解凍方式對羊肉羰基含量如表2所示。RT、LT、HT組肉樣的羰基含量顯著高于鮮肉羰基含量（P＜0.05），表明解凍會(huì)使得羰基含量上升。羰基含量上升將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致肌肉保水性下降。LHT組羰基含量最低（3.85nmol/mg），與鮮肉（3.48nmol/mg）差異不顯著（P＞0.05），表明LHT能夠有效抑制蛋白質(zhì)氧化。而RT組羰基含量最高，蛋白質(zhì)氧化最為嚴(yán)重，這可能與其解凍時(shí)間過長有關(guān)。長時(shí)間解凍可能導(dǎo)致了RT肉樣蛋白氧化、變性劇烈，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其蛋白水合能力下降，持水性變差。HT組羰基含量與LT組差異不顯著（P＞0.05），這說明HT可能與LT抑制蛋白羰基化的效果接近。

 

　　巰基是決定蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要基團(tuán)，總巰基含量越高，蛋白氧化程度越低。不同解凍方式對羊肉總巰基含量的影響如表2所示。與FM組（29.41nmol/mg）相比，RT（24.88nmol/mg）、LT（27.57 nmol/mg）、HT（26.96nmol/mg）、LHT（28.55 nmol/mg）組總巰基含量分別減少了15.4%、6.3%、8.3%、2.9%，表明解凍會(huì)使總巰基含量降低?？値€基含量減少意味著二硫鍵的生成。而生成的二硫鍵將導(dǎo)致肌原纖維蛋白交聯(lián)聚集，并且使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞。4種解凍處理組中，LHT組樣品總巰基含量較其他解凍方式最高，且與鮮肉差異不顯著（P＞005），其次是LT組，這可能是因?yàn)殪o電場抑制了自由基介導(dǎo)的肌原纖維蛋白氧化。HT組總巰基含量則略低于LT組，且二者差異不顯著（P＞0.05）。RT組則由于解凍時(shí)間過長總巰基含量最低，且顯著低于其他解凍組（P＜0.05）。

　　溶解度反映了肌原纖維蛋白變性的程度，溶解度越低變性程度越高。不同解凍方式下肌原纖維蛋白溶解度變化如表2所示。相比于FM組，經(jīng)過解凍后肉樣溶解度降低。這可能是解凍過程中蛋白質(zhì)氧化使得蛋白質(zhì)分子聚集導(dǎo)致。其中LHT組溶解度（29.98%）與FM組（32.83%）差異不顯著（P＞0.05），且顯著高于其他解凍處理組（P＜0.05）。說明因電場和高濕環(huán)境，LTH有效抑制了蛋白氧化，維持了蛋白質(zhì)構(gòu)象，具有較高的蛋白質(zhì)溶解度。RT組溶解度（18.91%）最低，并且顯著低于其他解凍組（P＜0.05），表明RT組蛋白質(zhì)變性最為嚴(yán)重。這與羰基和總巰基含量測定結(jié)果相一致?？赡苁荝T組長時(shí)間解凍導(dǎo)致了蛋白質(zhì)羰基含量和疏水基團(tuán)數(shù)目增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，蛋白質(zhì)間發(fā)生交聯(lián)，引起蛋白質(zhì)溶解度下降。

　　蛋白質(zhì)表面疏水性可作為評價(jià)蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸相對含量和蛋白質(zhì)變性程度的指標(biāo)。不同解凍方式對表面疏水性的影響如表2所示。與FM組（18.54μg）相比，RT組（30.07μg）、LT組（23.68μg）、HT組（24.68μg）表面疏水性顯著升高（P＜0.05）。表明解凍會(huì)導(dǎo)致疏水性殘基暴露進(jìn)而降低蛋白與水結(jié)合能力。這可能是因?yàn)榻鈨鲞^程中氧化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象展開，暴露出原先包埋在內(nèi)部的疏水性氨基酸。LHT組（21.90μg）表面疏水性與FM組差異不顯著（P＞0.05），表明LHT能夠有效抑制蛋白質(zhì)變性，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而RT組表面疏水性顯著高于其他解凍組（P＜0.05），蛋白質(zhì)變性最嚴(yán)重。
 

　　2.5 不同解凍方式對羊肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

　　酰胺I區(qū)譜帶（1 600～1 700 cm-1）常被用來估計(jì)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。不同解凍方式對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響如圖4所示。α-螺旋通常代表蛋白質(zhì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，無規(guī)卷曲則表示蛋白質(zhì)無序的結(jié)構(gòu)。FM組α-螺旋相對含量為40.42%，無規(guī)卷曲相對含量為15.48%，RT、LT、HT、LHT組α-螺旋相對含量分別為28.37%、34.99%、32.18%、37.79%，而無規(guī)卷曲相對含量分別為25.87%、22.32%、20.95%、15.54%，經(jīng)過不同方式解凍后肉樣α-螺旋相對含量降低，無規(guī)卷曲相對含量上升。

　　這與Bozzato等報(bào)道一致，解凍過程中蛋白質(zhì)氧化破壞了維持二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵，導(dǎo)致α-螺旋相對含量降低。而α-螺旋相對含量降低、無規(guī)卷曲相對含量上升說明蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并且影響肌肉持水性。4種解凍處理組中，RT組α-螺旋相對含量最低，而LHT組相對含量最高，表明RT組蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，LHT則能有效維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
 

圖4 不同解凍方式對羊肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響
 

　　2.6 不同解凍方式對羊肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

　　內(nèi)源熒光光譜可反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)色氨酸殘基微觀環(huán)境極性變化。不同解凍方式對肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響如圖5所示。相比于FM組，不同解凍方式下肌原纖維蛋白最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度均降低，表明經(jīng)過解凍后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)解折疊。Wang Bo等也報(bào)道了類似的結(jié)果，解凍處理會(huì)導(dǎo)致豬肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低。在4種解凍處理組中，LHT組內(nèi)源熒光強(qiáng)度最高，可能是經(jīng)過LHT處理的肌原纖維蛋白解折疊程度較低，只有少數(shù)位于蛋白質(zhì)中心的色氨酸殘基暴露在極性溶劑環(huán)境中。而RT組由于過度的蛋白氧化促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致其內(nèi)源熒光強(qiáng)度最低。通過分析最大發(fā)射波長（λmax）的位移可以判斷色氨酸殘基微環(huán)境變化。FM組λmax位于334nm處，表明色氨酸殘基位于疏水性環(huán)境中。其他4種解凍處理組中只有RT組λmax發(fā)生紅移（向長波方向移動(dòng)至335nm），表明經(jīng)過RT處理后蛋白解折疊，致使埋藏在蛋白結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基暴露在極性溶劑中。

圖 5 不同解凍方式對羊肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響
 

　　2.7 不同解凍方式對羊肉肌原纖維蛋白紫外光譜的影響

　　紫外二階導(dǎo)光譜可用于解析蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。不同解凍方式對肌原纖維蛋白紫外二階導(dǎo)光譜的影響如圖6所示。FM組在288nm和296nm處出現(xiàn)波峰，在284nm和291nm處出現(xiàn)波谷。288nm處的波峰由酪氨酸和色氨酸殘基共同作用，而296nm處波峰僅歸屬于色氨酸殘基。與FM組相比，不同解凍組的288nm處波峰發(fā)生藍(lán)移（向短波方向移動(dòng)），酪氨酸和色氨酸微觀環(huán)境極性增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)展開，增加了表面疏水性。RT、HT組在296nm處波峰紅移（向長波方向移動(dòng)），說明蛋白質(zhì)構(gòu)象展開，并且疏水性氨基酸殘基暴露至蛋白表面。兩個(gè)波峰與波谷之間距離比值r＝a/b（振幅比）能夠反映出酪氨酸極性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開變化。對于酪氨酸，其r值隨著溶劑極性的降低而減小，而對于色氨酸，其r值幾乎不依賴于溶劑極性。相比于FM組樣品，RT、LT、HT、LHT組樣品的r值分別增加至1.44、1.38、1.38、1.35，說明由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境中的酪氨酸暴露在蛋白質(zhì)表面極性區(qū)域中。這與Zhao Juyang等的研究結(jié)果一致，說明經(jīng)過解凍后，由于蛋白質(zhì)構(gòu)象展開使得埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境中的色氨酸和酪氨酸殘基暴露在蛋白質(zhì)表面極性區(qū)域中。這與本研究中的內(nèi)源熒光光譜分析結(jié)果一致。

　　2.8 相關(guān)性分析

　　不同解凍方式下羊肉理化指標(biāo)的相關(guān)性如圖7所示。解凍時(shí)間與解凍損失率、羰基含量、表面疏水性、r值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與自由水、無規(guī)卷曲相對含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總巰基含量、溶解度、α-螺旋相對含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與內(nèi)源熒光強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；解凍損失率與自由水相對含量、羰基含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總巰基含量、溶解度、α-螺旋相對含量、熒光強(qiáng)度、不易流動(dòng)水相對含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與表面疏水性、r值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；自由水相對含量與羰基含量、表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總巰基含量、溶解度、α-螺旋相對含量、不易流動(dòng)水相對含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；羰基含量、總巰基含量變化對溶解度、表面疏水性及蛋白質(zhì)構(gòu)象均有顯著或極顯著影響。由相關(guān)性分析可知，隨著解凍時(shí)間延長，蛋白質(zhì)氧化程度加深，蛋白構(gòu)象的完整性遭到破壞，與水結(jié)合能力下降，解凍后部分不易流動(dòng)水無法與變性蛋白相結(jié)合而發(fā)生遷移至細(xì)胞外空間“態(tài)變”為自由水，導(dǎo)致解凍后汁液流失增加。

圖7 冷凍羊肉解凍特性與解凍后品質(zhì)的相關(guān)性分析
 

　　3 結(jié) 論
 

　　通過對不同解凍方式下羊肉持水性表征及與肌肉持水性相關(guān)的蛋白特性分析，明確了與RT處理相比，LT、HT、LHT 3種解凍方式均能縮短解凍時(shí)間，抑制蛋白質(zhì)氧化變性，維持蛋白質(zhì)構(gòu)象，延緩水分遷移，并減少汁液流失，且LHT處理維持解凍后羊肉持水性的效果最好。因此，低壓靜電場結(jié)合高濕解凍能夠作為一種有效減少羊肉解凍過程中汁液流失的方法。