前言
非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率可達100%。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。
1921年，ASF最初發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，上世紀五、六十年代在非洲、歐洲、南美洲流行。2018年8月初我國爆發(fā)非洲豬瘟首起疫情以來，該疫病已蔓延全國 23個省，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)和國民經(jīng)濟帶來巨大損失。由于ASFV感染機制復雜，目前世界范圍內(nèi)至今尚無有效預防用非洲豬瘟疫苗，因此早期發(fā)現(xiàn)、精準檢測是控制該病傳播和發(fā)生的關(guān)鍵。
本文參考了OIE關(guān)于非洲豬瘟防控的文件、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布相關(guān)文件和中國動物衛(wèi)生與流行病學中心、中國動物疫病預防控制中心的相關(guān)技術(shù)手冊，結(jié)合我們的研究成果，從非洲豬瘟早期發(fā)現(xiàn)、現(xiàn)場排查、精準檢測三個方面的技術(shù)要點編寫而成，主要面向從事非洲豬瘟現(xiàn)場排查和檢測的一線防疫人員，提供了簡明實用的相關(guān)操作技術(shù)與方法，為非洲豬瘟現(xiàn)場排查與檢測等相關(guān)工作提供參考。
一、概述
非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種有囊膜的DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。ASFV粒子直徑約為200納米，呈正20面體結(jié)構(gòu)，由多層同心圓結(jié)構(gòu)組成，由內(nèi)到外依次是基因組DNA、基質(zhì)層、內(nèi)膜、核衣殼和外囊膜。ASFV的基因組為線性雙鏈DNA，大小約為170～193kb，含有150～167個開放閱讀框(ORFs)，由一個大約125kb的中心保守區(qū)和兩個含5種多基因家族(MGFs)的變異末端組成。依據(jù)編碼主要衣殼蛋白p72的基因B646L的部分核苷酸序列，ASFV可以被分為24個基因型。
首次發(fā)現(xiàn)的傳入我國的ASFV毒株屬于基因II型。ASFV的衣殼蛋白p72，膜蛋白p54、p30和p12具有良好的抗原性。在感染豬或康復豬體內(nèi)，50余種病毒蛋白可誘導抗體應答，可用做血清學診斷的抗原。自然感染條件下，ASF的潛伏期為3～19天，感染豬在潛伏期即可排毒，臨床癥狀出現(xiàn)后可通過分泌物和排泄物大量排毒。
ASFV耐受酸堿的范圍較廣，pH4～10條件下在無血清的培養(yǎng)基中保持穩(wěn)定，但在pH值低于4或高于11.5，數(shù)分鐘內(nèi)可被滅活。ASFV對環(huán)境的抵抗力很強，在尸體中可存活6個月以上，在低溫條件下可存活數(shù)年；在腐敗的血液中可存活近4個月；在冷鮮肉中存活數(shù)周至數(shù)月；在腌制和熏制的豬肉產(chǎn)品中可長時間存活；在糞便中可保持感染性數(shù)周。
ASFV對熱的抵抗力較弱，60℃20分鐘或56℃70分鐘可被滅活。一般的消毒措施均可有效殺滅ASFV。最有效的消毒劑是去污劑、次氯酸鹽、堿類及戊二醛。
ASF的自然傳播速度慢，高度接觸傳播，直接接觸、采食、蜱蟲叮咬、注射等可傳播疫病。消化道(口)和呼吸道(鼻)是ASFV的主要感染途徑。蒼蠅、蚊、鼠等可機械性傳播ASFV。
傳染源：帶非洲豬瘟病毒野豬和發(fā)病家豬的分泌物及排泄物、含有病死豬組織或非洲豬瘟病毒污染的泔水、含非洲豬瘟病毒的豬肉及其制品，以及鈍緣軟蜱。
傳播途徑：感染豬與健康易感豬的直接接觸可傳播非洲豬瘟病毒。非洲豬瘟病毒可通過飼喂污染的泔水、污染的飼料、墊草、車輛、設(shè)備、衣物等間接傳播。鈍緣蜱屬的軟蜱，特別是O.moubata(非洲)和O.erraticus(歐洲)是非洲豬瘟病毒(ASFV)的宿主和傳播媒介。消化道和呼吸道是最主要的感染途徑。
易感動物：家豬和野豬。其它哺乳動物包括人類均不感染非洲豬瘟病毒。目前報道的發(fā)病豬群主要是飼喂非洲豬瘟病毒污染泔水的豬。不同品種、日齡和性別的豬均對非洲豬瘟病毒易感。
潛伏期：家豬為3天到19天不等。
非洲豬瘟(ASF)是能引起不同品系、不同年齡家豬和野豬一系列綜合征的疾病。急性豬瘟表現(xiàn)為高燒、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血，死亡率高。ASFV有強毒力、中等毒力和低毒力等三種類型毒株。臨床上可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。
最急性型：發(fā)病豬體溫達 41℃～42℃，呈現(xiàn)厭食、食欲廢絕、精神沉郁、皮膚充血等癥狀，1～4天內(nèi)死亡。也有無癥狀死亡的豬。發(fā)病率和病死率均可達100%。
急性型：發(fā)病豬體溫達 40℃～42℃，呈現(xiàn)厭食、不愿活動、皮膚發(fā)紅、嘔吐、鼻腔出血、血便、便秘等。妊娠母豬流產(chǎn)。病死率可達90%～100%。
亞急性型：與急性型類似。病豬出現(xiàn)中度發(fā)熱，食欲下降。皮膚出血和水腫，感染后7～20天死亡，病死率為30%～70%。
慢性型:病豬體重下降、生長不良，呈現(xiàn)間歇熱，耳部、腹部和大腿內(nèi)側(cè)皮膚發(fā)生壞死或潰瘍，關(guān)節(jié)腫大，感染豬可出現(xiàn)呼吸道癥狀。
ASF的實驗室診斷分為病原學診斷(包含病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的檢測)和抗體檢測。依據(jù)地區(qū)或國家的疾病情況及診斷實驗室的能力選擇合適的診斷方法。
鑒定病原：國家法定實驗室診斷必須進行豬原代巨噬細胞或骨髓培養(yǎng)接種分離病毒，用熒光抗體試驗(FAT)檢測組織涂片或冷凍切片中的抗原，用PCR方法檢測基因組DNA。PCR是一種優(yōu)良的、靈敏的、快速的ASFV檢測技術(shù)，在很多情況下都是非常有用的。特別是組織不適合病毒分離和抗原檢測的情況。
在可疑病例中，病料在豬原代巨噬細胞培養(yǎng)物中傳代，并重復上述過程。
血清學試驗：耐受過ASF自然感染的豬通常在感染后7～10天產(chǎn)生抗ASFV抗體，這些抗體持續(xù)很長一段時間。疾病地方性流行，或者是由低毒力毒株引起的最初的爆發(fā)，對于新爆發(fā)的研究需要包括對送檢的血清中的特殊抗體和組織滲出液進行檢測。很多方法，如間接熒光抗體(IFA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫印跡試驗可用于抗體檢測。
二、早期發(fā)現(xiàn)
為盡早發(fā)現(xiàn)ASF疫情，首先要讓豬場全體員工熟悉ASF的臨床癥狀。了解周邊三公里范圍內(nèi)的養(yǎng)豬場戶、屠宰場點、生豬交易場所、無害化處理場等情況，密切關(guān)注周邊生豬異常死亡情況，及時發(fā)現(xiàn)疫情隱患。
時刻關(guān)注本豬場各個環(huán)節(jié)的豬只異常情況，包括豬只的精神狀態(tài)、采食情況、體溫變化、體表變化和經(jīng)產(chǎn)母豬表現(xiàn)等。目前我國大多數(shù)的ASFV感染病例屬于急性-亞急性。通常，ASF急性-亞急性的癥狀主要包括：發(fā)燒、昏睡、厭食、皮膚出血以及循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)出現(xiàn)問題并伴有神經(jīng)失調(diào)。
精神狀態(tài)：及時發(fā)現(xiàn)欄舍內(nèi)眼神異常豬只(這時豬只可能還未排毒)、精神沉郁的豬只，并及時采樣和送檢。豬場要積極發(fā)動一線員工關(guān)注異常豬只，對于提前發(fā)現(xiàn)豬只異常并及時采樣經(jīng)實驗室檢測陽性的，給予相應獎勵。
采食情況：關(guān)注群體和個豬只的采食情況，對于采食量稍微減少(排除飼料因素)，要盡快采樣送檢。采食量明顯下降的豬只一般會伴隨著體溫升高。
體溫變化：正常保育豬、育肥豬體溫一般在39℃～40℃之間；正常成年基礎(chǔ)豬群的體溫在38℃～39℃之間(其中母豬發(fā)情、分娩前后幾天，體溫會升到39℃～40℃之間)。如果發(fā)現(xiàn)體溫超過正常范圍的豬只，應及時采樣送檢。為了防止測量體溫時交叉污染，體溫計必須一豬一換，須戴手套和穿防護服；可采用遠紅外體溫計測溫，盡量不入欄。
體表變化：看到皮膚發(fā)紅豬只，表明豬只處于發(fā)燒狀態(tài)。另外，有些豬只打針時出現(xiàn)凝血不良。對于這些異常豬只，要及時采樣進行檢測。
經(jīng)產(chǎn)母豬的表現(xiàn)：經(jīng)產(chǎn)母豬除上述臨床表現(xiàn)外，還會出現(xiàn)流產(chǎn)。ASF造成流產(chǎn)有別于其它疫病常見的黑胎或白胎，會出現(xiàn)胎兒均質(zhì)發(fā)紅。
一旦發(fā)現(xiàn)可疑癥狀，第一時間采樣送檢(采樣優(yōu)先順序：鼻腔拭子＞唾液＞陰門拭子＞肛門拭子)。
三、現(xiàn)場排查
圖1 排查工作流程示意圖(中國動物疫病預防控制中心排查手冊)
?。ㄒ唬蕚涔ぷ?/strong>
1.人員準備
了解非洲豬瘟基本知識(基本的生物學特征、流行病學特點、臨床表現(xiàn)、剖檢病理變化等)。
了解非洲豬瘟感染與傳播的高風險因素(飼喂泔水、生物安全水平低、動物販運、豬肉及其制品流通)。
了解排查工作中需遵守的生物安全操作要求，避免人為造成的傳播。
養(yǎng)殖戶等相關(guān)人員可能面臨較大壓力，應注意工作方式方法。
2.車輛準備
車輛必須徹底清洗消毒。
車輛不攜帶無關(guān)物品。
在車內(nèi)、車的后備箱里鋪塑料布防止污染。
3.物品準備(生物安全防護及采樣所需物品)
(1)進場所需材料清單
膠靴；一次性生物安全防護服；口罩；鞋套或靴套；一次性乳膠手套；消毒劑及噴壺(適用于非洲豬瘟病毒的消毒劑)。
?。?）采樣所需材料清單
垃圾袋(包括生物危險品垃圾袋)；自封袋(用來裝手機或其他設(shè)備)；面部用消毒濕巾；密封用膠帶；護目鏡；洗滌劑及刷子；
一般材料：
標簽和記號筆；數(shù)據(jù)記錄表、筆、寫字板；盛放針頭和刀片的銳器盒；高壓滅菌袋；用于環(huán)境采樣的拭子和盛放拭子用的離心管。
樣品包裝運輸所需材料
容器/離心管/小瓶(防漏并標示清楚)；吸水紙；密封性好的容器或袋子，作為二次包裝(即防漏)、用于儲存動物樣品的容器和采血管；冷藏箱(+4℃)；便攜式-80℃冷凍箱/干冰/液氮罐(僅在遠離設(shè)備齊全的實驗室進行取樣時才需要)；
保定動物的材料(如，套索、木板)。
采血所需材料
消毒劑和脫脂棉(酒精棉)；不含抗凝劑的無菌采血管(10mL)(紅色蓋子)；含有 EDTA的無菌采血管(10mL)(紫色蓋子)；根據(jù)豬的大小和采樣部位(頸靜脈、耳緣靜脈)選取真空采血管或 10～20mL注射器。
(二)進出養(yǎng)殖場要求
1.抵達養(yǎng)殖場
車輛停在養(yǎng)殖場入口附近，不得駛進場內(nèi)。
在養(yǎng)殖場指定的地點(清潔區(qū))，穿戴個人防護設(shè)備(如需要，應遵循養(yǎng)殖場的要求進行個人防護)，并進行物資的準備、制備消毒劑等。
進入養(yǎng)殖場生產(chǎn)區(qū)域前，脫下和摘掉不必要的衣服和物品(夾克、領(lǐng)帶、手表等)，清空衣服口袋，按照養(yǎng)殖場進場程序(沐浴洗澡或其他方式)進入生產(chǎn)區(qū)域。
電子設(shè)備(移動電話等)應放置在密封的塑料袋中，以便隨后進行清潔和消毒。在養(yǎng)殖場內(nèi)，只能通過塑料袋使用手機，不要從袋子里拿出。
其他非一次性物品，應在消毒后進場。如需要，應按照養(yǎng)殖場物資進場程
序進行消毒后進場。
消毒工作要在清潔干燥的地面進行(最好是混凝土地面)，應劃分清潔和非清潔區(qū)并保證界線清晰。
2.穿戴個人防護設(shè)備(在清潔區(qū))
脫下鞋子，并放在塑料布上。
在遵守養(yǎng)殖場進場要求的前提下，部分場需要脫去全部個人衣服，洗澡后穿戴養(yǎng)殖場內(nèi)部衣服方可進場。
部分場可以首先穿戴一次性防護服，穿上靴子。戴手套，手套要用膠帶封上。
如果需要穿防水服，防水服應套在靴子外層。再戴一層手套，方便中間更換。
靴套至少覆蓋膠鞋底部和下部。
進場前，戴口罩并仔細檢查物品清單。
3.離場前準備
在非清潔區(qū)域?qū)佑|過養(yǎng)殖場的所有物品進行清洗和消毒處理。
對盛放樣品容器的表面進行消毒，然后放在清潔區(qū)。
脫下鞋套放入非清潔區(qū)的垃圾袋中，然后徹底擦洗靴子(特別是鞋底)。
脫下手套并放入非清潔區(qū)的垃圾袋中。
脫下一次性防護服并放入非清潔區(qū)的垃圾袋中。
脫下靴子，對靴子進行消毒后放入清潔的袋子里。
手和眼鏡也必須進行消毒，并用消毒濕巾清潔臉部。
進入生產(chǎn)區(qū)域的人員在指定區(qū)域進行沐浴洗澡更衣后方可離開。
非一次性物品(膠靴等)和盛放樣品的容器用雙層袋盛放并膠帶封裝。可穿回日常的鞋子。
攜帶出養(yǎng)殖場的袋子需放在車輛內(nèi)預先鋪好的塑料布上。
進入生產(chǎn)區(qū)域的人員在指定區(qū)域進行沐浴洗澡更衣后方可離開。
接觸過樣品或潛在污染的車輛進行重點清洗消毒。
在離開可能受到污染的區(qū)域之前，清潔和消毒汽車的輪胎和表面。清除所有可見的污垢。不要忘記清理隱藏的區(qū)域，如車輪拱、輪胎板和汽車底部。清除所有污垢后，用消毒劑噴灑表面。
處理車內(nèi)所有垃圾并清理所有污垢(應妥善處理垃圾)。
用浸有消毒劑的布擦拭方向盤、變速桿、踏板、手閘等。
4.離場后
如家中沒有飼養(yǎng)生豬，可以回家淋浴并徹底清洗頭發(fā)。將當天所穿衣服浸泡在消毒劑中30分鐘；如果家中飼養(yǎng)生豬，應在其他地方進行清洗。
如果進入了疑似感染場，確診前不應前往任何飼養(yǎng)生豬的場所。如果確認該場感染了非洲豬瘟，三天內(nèi)不應前往任何有豬的場所。
再次對汽車內(nèi)部和外部進行消毒。清除汽車上的所有塑料布，并妥善處理。
5.消毒劑的選擇
非洲豬瘟病毒對熱的抵抗力較弱，一般的消毒措施都可以將病毒殺滅，但是在感染病豬組織以及在低溫的條件下病毒存活時間可達6個月以上乃至數(shù)年。
最有效的消毒劑是去污劑、次氯酸鹽、堿類及戊二醛。
8/1000的氫氧化鈉(30分鐘)、2%～3%次氯酸鹽氯(30分鐘)、3/1000福爾馬林(30分鐘)、3%鄰苯基苯酚(30分鐘)可滅活病毒。
堿類(氫氧化鈉、氫氧化鉀等)、氯化物和酚化合物適用于建筑物、木質(zhì)結(jié)構(gòu)、水泥表面、車輛和相關(guān)設(shè)施設(shè)備消毒，酒精和碘化物適用于人員消毒。
不易消毒的設(shè)備放置在陽光下暴曬消毒。
（三）臨床診斷
非洲豬瘟病豬主要臨床表現(xiàn)差異較大，不易識別，但通常有以下幾種或全部典型癥狀，包括高熱、嘔吐、腹瀉或便秘，有的便血，虛弱、難以站立，體表不同部位(尤其是耳、鼻、腹部、臀部)皮膚呈紅色、紫色或藍色，有的咳嗽、呼吸困難，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎。出現(xiàn)上述臨床癥狀后，一般2～10天內(nèi)死亡。剖檢可見內(nèi)臟多個器官組織出血，脾臟顯著腫大，顏色變暗，質(zhì)地 變脆。部分首次發(fā)生非洲豬瘟的養(yǎng)殖場，豬群發(fā)病非常急，最急性型不表現(xiàn)任何癥狀而突然死亡，無特殊臨床表現(xiàn)和剖檢病變。
1.臨床癥狀
根據(jù)其毒力，ASFV分為三個主要類別：高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力毒株。ASF的臨床表現(xiàn)形式從特急性(非常急)到無癥狀(不明顯)。目前我國大多數(shù)的ASFV感染病例屬于急性-亞急性。非洲豬瘟的特征通常是豬突然死亡、死前呈現(xiàn)體溫升高。臨床表現(xiàn)從感染7天之內(nèi)急性死亡，到持續(xù)幾周或幾個月的慢性感染不等(圖2略)。
主要臨床癥狀:
□ 無癥狀突然死亡；
□ 發(fā)病率、病死率高；
□ 高熱，體溫升高 40.5℃～42℃；
□ 耳、四肢、腹背部皮膚有出血點、發(fā)紺；
□ 嘔吐，腹瀉或便秘，糞便帶血；
□ 虛弱、步態(tài)僵直，不愿站立等；
□ 偶見眼、鼻有黏液膿性分泌物。
其他臨床癥狀:
□ 精神沉郁、食欲下降；
□ 呼吸困難，濕咳；
□ 關(guān)節(jié)疼痛、腫脹；
□ 妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔。
2.剖檢病變
非洲豬瘟特征性剖檢病變通常是可見多臟器出血。
最明顯的剖檢病變是：
□ 淋巴結(jié)(特別是胃腸和腎)增大、水腫以及整個淋巴結(jié)出血，形態(tài)類似于血塊；
□ 脾臟顯著腫大，一般情況下是正常脾的3～6倍，顏色變暗，質(zhì)地變脆；
□ 腎臟表面瘀點(斑點狀出血)(圖 3)。
剖檢變化還可能包括:
□ 皮下出血；
□ 心包積液和體腔積水、腹水；
□ 心臟表面(心外膜)、膀胱和腎臟(皮質(zhì)和腎盂)的出血點；
□ 肺可能出現(xiàn)充血和瘀點，氣管和支氣管有泡沫，嚴重肺泡和間質(zhì)性肺水腫；
□ 瘀點、瘀斑(較大的出血)，胃、小腸和大腸中過量的凝血；
□ 肝充血和膽囊出血(圖4略)。
3.鑒別診斷
非洲豬瘟的臨床表現(xiàn)多樣，嚴重程度也不一樣，ASF臨床癥狀與古典豬瘟(CSF)、豬丹毒癥、沙門氏菌病、放線桿菌病、其他敗血癥、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)的臨床癥狀非常類似，有時候容易混淆(表1)。
表1 非洲豬瘟鑒別診斷
| 臨床體征 | 非洲豬瘟 | 豬瘟 | 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 | 丹麥 | 沙門氏菌?。ㄘi霍亂沙門菌） | 巴氏桿菌病 | 偽狂犬病 | 豬皮炎腎病綜合征（豬圓環(huán)病毒病） |
| 法定報告疫病 | √ | √ | √ | |||||
| 可用疫苗 | √ | √ | √ | √ | √ | |||
| 治療方案 | √ | √ | ||||||
| 發(fā)熱 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 食欲不振 | √ | √ | √ | √ | √ | |||
| 沉郁 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | |
| 紅色至紫色皮膚病變 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||
| 呼吸困難 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||
| 嘔吐 | √ | √ | √ | |||||
| 腹瀉 | √ | √ | √ | |||||
| 腹瀉帶血 | √ | √ | ||||||
| 高死亡率 | √ | √ | √ | |||||
| 突然死亡 | √ | √ | √ | |||||
| 流產(chǎn) | √ | √ | √ | √ | √ | |||
| 臨床癥狀鑒別 | 結(jié)膜炎、共濟失調(diào)、幼豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、蜷縮姿勢、便秘可能會導致黃灰色腹瀉、更長的臨床過程。 | 呼吸窘迫的強度不同。 | 待出欄豬常見菱形皮膚病變。 | 淡黃色的腹瀉、中樞神經(jīng)癥狀包括震顫、虛弱、癱瘓和抽搐。 | 有不同嚴重程度的發(fā)病。 | 體征各不相同，主要取決于免疫狀況。體溫過低、震顫、共濟失調(diào)、癲癇發(fā)作。出現(xiàn)鼻炎和打噴嚏。 | 常見于生長/育肥豬。 | |
| 擴大的深紅色至黑色和易碎的脾臟 | √ | |||||||
| 腎臟出血 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||
| 出血性淋巴結(jié) | √ | √ | √ | |||||
| 淋巴結(jié)腫大 | √ | √ | √ | √ | ||||
| 粘膜出血 | √ | √ | √ | |||||
| 體腔和心臟周圍有多余的液體 | √ | |||||||
| 肺炎 | √ | √ | √ | √ | √ | |||
| 部檢鑒別 | 在胃腸道、會厭和喉部黏膜上出現(xiàn)壞死或“扣狀”潰瘍、腦炎、患有CSF的豬體重快速下降，脾臟邊緣蒼白。 | 間質(zhì)性肺炎、無脾臟增大、胸腺萎縮。 | 關(guān)節(jié)炎和增生性心內(nèi)膜炎、在胸膜和腹膜出血、外周淋巴結(jié)病變，而不胃肝和腎淋巴結(jié)。 | 腸炎和偶發(fā)性腦炎、壞死性心內(nèi)膜炎。肝臟米粒狀壞死灶、在脾臟和淋巴結(jié)中不存在血管病變。 | 肺與胸腔粘連。 | 灶性壞死和腦脊髓炎病變發(fā)生在大腦、小腦、腎上腺和其他臟器，如肺、肝或脾。在胎兒或幼仔豬中，肝臟上的白斑是特征性病變。壞死性腸炎。 | 變大且發(fā)白的腎臟體腔積液、皮下水腫、胃潰瘍、關(guān)節(jié)滑液增多。 |
注：參考聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)《動物生產(chǎn)及動物衛(wèi)生手冊》和中國動物疫病預防控制中心《非洲豬瘟現(xiàn)場排查手冊》
4.發(fā)現(xiàn)疑似病例的情況下應立即采取的行動
發(fā)現(xiàn)疑似病例，應立即按照《非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》和《非洲豬瘟疫情應急預案》要求上報疫情(見附件一)。
（四）樣品采集、包裝與運輸
1.采樣方法
ASF樣品有效而準確采集是實現(xiàn)ASF快速精準檢測的非常關(guān)鍵步驟。當疫情暴發(fā)(被動監(jiān)測)時，應針對患病豬、死亡豬及豬舍環(huán)境進行采樣；而在常規(guī)監(jiān)測時，應對ASFV易感豬群及環(huán)境(如出豬臺、場區(qū)大門等風險較大的地方) 進行采樣；如果是針對處于精準清除的群體，采樣的數(shù)量可以適當加大。采樣應注意避免交叉污染，并在采集每頭豬只后更換一次性手套。觸碰豬只、料槽、欄桿后，及時更換一次性手套。采血時，必須做到每采集1頭豬只更換 1個新的針頭，以免造成ASFV傳播。提交到診斷實驗室的相關(guān)樣品應有清晰且保存持久的標簽，樣品質(zhì)量良好。所有采樣后的防護用品焚燒或高壓處理。
樣品類型:
口鼻拭子
將每頭豬口、鼻拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢測的準確性和減少工作量。拭子裝于Eppendorf管內(nèi)，建議將樣品保存于4℃，立刻送檢，沒有實驗條件的應在24小時內(nèi)送至有資質(zhì)的實驗室。
全血
采血過程中應保持無菌操作。
采血前，先用酒精棉對采血部位進行局部消毒。
采血完畢，進行局部消毒并用干棉球按壓止血。
使用含有抗凝血劑(EDTA-紫色蓋)的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血。
如果動物已經(jīng)死亡，可立即從心臟中采血。避免使用含肝素的真空采血管(綠色蓋子)。
血清
使用未加抗凝劑(紅色蓋子)的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈、耳緣靜脈采血，或剖檢過程收集血液樣品。
靜置分離后，收集血清。如果血清是紅色，這表明樣品發(fā)生了溶血。通常已經(jīng)死亡動物的血液樣品易發(fā)生溶血。
血清樣品在分離后可以立即開展檢測，如果需要儲存，對于抗體檢測，儲存在-20℃，但是對于病毒檢測，最好儲存于-80℃。
器官和組織樣品
可采集脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟樣品。脾臟和淋巴結(jié)的病毒含量最高。
對于死亡時間較長的動物，可采集骨髓樣品，也可采集關(guān)節(jié)內(nèi)組織液。
建議將樣品保持在4℃，盡快提交給實驗室。如無法及時送樣，可將樣品儲存在冷庫或液氮中。
樣品用10%緩沖福爾馬林浸泡30分鐘以上，病毒可被滅活，可用于PCR檢測。
樣品的最小需求量：血清1mL；全血1mL；組織樣品10g。
環(huán)境樣品
可多點采集養(yǎng)殖場軟蜱等媒介和環(huán)境拭子，如糞便、泔水、飼料等。
軟蜱等媒介樣品：鈍緣蜱可以用于檢測ASFV。有三種收集技術(shù)：手動收集、
二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應讓蜱保持存活或直接儲存在液氮中，避免DNA降解。
其它環(huán)境樣品：以區(qū)塊為單位，對風險等級進行區(qū)域采樣。如豬場內(nèi)所有墻體、地面、設(shè)備等表面進行全覆蓋采樣。
生產(chǎn)區(qū)內(nèi)：包括各區(qū)間豬舍內(nèi)所有區(qū)間單元墻體、地面、風機、地溝、設(shè)備、水線、料線等。采樣應全覆蓋包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。
生產(chǎn)區(qū)外：對可能的風險區(qū)域進行采樣，包括出豬臺、場區(qū)大門、料塔、下水道、員工宿舍、儲物間、浴室、辦公室、餐廳廚房、車輛、水源等所有可能受到污染的區(qū)域。
建議樣品4℃以下保存。
2.樣品的記錄、保存、包裝和運送
為保證準確診斷，必須在適當溫度下、以最快速度，將樣品仔細包裝、做好標記和相關(guān)記錄，以最快路線送到最近的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定的實驗室。樣品運輸必須遵守農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動物病原微生物菌(毒)種運輸包裝規(guī)范》等規(guī)定。
采樣之前必須致電相關(guān)實驗室，確保遵循正確的樣品提交程序，保證所送樣品能在第一時間完成檢測及儲存。
做好樣品運輸過程中的安全保障工作，避免在運輸途中感染其他動物，避免樣品被污染。
運送的樣品必須附有足夠數(shù)量的冷卻材料(如冰袋)，以防變質(zhì)。
采樣信息記錄
采樣同時，應填寫采樣單。
采樣單應用鋼筆或簽字筆逐項填寫(一式三份)。
樣品標簽和封條應用簽字筆填寫。
保溫容器外封條應用鋼筆或簽字筆填寫。
小塑料離心管上可用記號筆做標記。
應將采樣單和病史資料裝在塑料包裝袋中，并隨樣品送實驗室，每個樣品應能對應到來源動物。
樣品信息至少應包括以下內(nèi)容：
畜主姓名和養(yǎng)殖場地址；
養(yǎng)殖場飼養(yǎng)動物品種及數(shù)量；
疑似或被感染動物或易感動物種類及數(shù)量；
首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期；
感染動物在畜群中的分布情況；
死亡動物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動物數(shù)量及年齡；
臨床癥狀及其持續(xù)時間，死亡情況和時間等；
飼養(yǎng)類型和標準，包括飼料來源等；
送檢樣品清單和說明，包括病料種類、保存方法等；
動物免疫和治療史；
送檢者的姓名、地址、郵編、電話和郵箱；
送檢日期；
采樣人和被采樣單位簽章。
樣品包裝要求
采集好的樣品應仔細進行包裝，做好標記并送到實驗室。樣品應使用“三重包裝系統(tǒng)”，保障運輸過程中的生物安全，并避免樣品受到污染。
推薦樣品使用“三重包裝系統(tǒng)”，并正確標記，以防止泄漏，內(nèi)附采樣單。
直接盛裝容器。樣品應該儲存在密封、無菌的主容器中，根據(jù)檢驗樣品性狀及檢驗目的選擇不同的容器，如圖5所示。每個樣品容器外應做好標記，注明樣品名、樣品編號、采樣日期等，要能明確識別來自于哪只動物。
二次包裝。吸收材料也應放置在二次容器內(nèi)。如果將多個易碎的主容器放置在單個二次容器中，則必須單獨包裝或分離，以防止相互接觸。二次包裝容器應貼封條，封條上應有采樣人簽章，并注明貼封日期，標注放置方向。
堅硬的外部包裝。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4升，在固體物質(zhì)的情況下不得超過4公斤(不包括冰的重量)。樣品必須保持4℃溫度或更低溫度，并就近送動物疫病預防控制機構(gòu)進行保存。注意：切勿凍結(jié)全血或混合有血凝塊的血清。
外包裝標簽和標記：“B類感染物質(zhì)”標簽，其正確的運輸名稱旁邊標注“B類感染物質(zhì)”；
采樣負責人的全名、地址和電話號碼；
實驗室聯(lián)系人的全名、地址和電話號碼；
標簽上標明“在4℃”、“在-20℃”或“在-80℃”保存；
圖5 B類感染物質(zhì)的包裝標簽和三重包裝系統(tǒng)的例子
注：參考聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）《動物生產(chǎn)及動物衛(wèi)生手冊》和中國動物疫病預防控制中心《非洲豬瘟現(xiàn)場排查手冊》
3.廢棄物處理
采樣結(jié)束后，做好尸體、場地、物品、個人防護用品的消毒和無害化處理。對不同場點盡量安排不同的采樣人員，避免交叉污染。
四、實驗室診斷與確診
1.快速精準檢測
實時熒光定量PCR（qPCR）是實驗室快速檢測 ASFV的常用方法。大型養(yǎng)豬企業(yè)可建設(shè)ASFV檢測實驗室，當豬場周邊和自己豬場受到威脅時做好疫情排查與監(jiān)測，為疫情處置和精準清除提供技術(shù)支撐。開展qPCR檢測必須配備專用的實時熒光PCR儀和相應檢測試劑。實驗室可以根據(jù)技術(shù)標準開展ASFV的qPCR檢測。由于qPCR檢測技術(shù)靈敏，極其微量的污染即可造成假陽性，對PCR實驗室進行分區(qū)管理可以避免檢測污染。應根據(jù)條件將 PCR實驗室分為試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、產(chǎn)物擴增區(qū)等。
2.疫情確診
中國動物衛(wèi)生與流行病學中心或省級動物疫病預防控制中心實驗室可以按
要求確診ASF疫情。
ASF實驗室診斷技術(shù)一覽表（譯者注：XXX代表最高，X代表一般）
| 病毒檢測 | 時間 | 敏感性 | 特異性 | 樣品類型 | 費用 | 說明 |
| 聚合酶鏈反應（PCR）* | 5-6小時 | XXX | XX | 組織、血液、蜱或細胞培養(yǎng) | $$ | 最常見的方法，容易受到污染，檢測活的或滅活的病毒。 |
| 紅細胞吸附試驗（HA） | 7-21天 | XXX | XXX | 豬巨噬細胞 | $$$$ | 黃金標準僅在部分參考實驗室中使用。 |
| 直接熒光抗體檢測（FAT） | 75分鐘 | XXX用于早期發(fā)現(xiàn) | XXX | 冷凍切片、印記涂片。浸出液的細胞養(yǎng)物。 | $$$ | 推薦在PCR不可用時或缺乏經(jīng)驗使用。需要熒光顯微鏡感染一周后，敏感性下降。 |
| 酶聯(lián)免疫吸附試驗（EUSA） | 3小時 | X（用于早期發(fā)現(xiàn)） | XX | 血清、浸出液 | $ | 不經(jīng)常使用，對感染后第一周內(nèi)的樣品，缺乏敏感性。 |
| 酶聯(lián)免疫吸附測驗（EUSA）* | 3小時 | X | X | 血清 | $ | 篩查試驗。內(nèi)部自建方法和商業(yè)試劑盒均可使用。 |
| 免疫印跡實驗 | 3小時 | X | X | $$$$ | 確診技術(shù)。無商業(yè)試劑盒。 | |
| 間接熒光抗體試驗（IFA) | 4小時 | XXX | XXX | $$$ | 確診技術(shù)。無商業(yè)試劑盒，需要熒光顯微鏡。 |
(*)：最常用
圖6 非洲豬瘟實驗室診斷技術(shù)
注：參考聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)《動物生產(chǎn)及動物衛(wèi)生手冊》
附件一：非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范
非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。
為防范、控制和撲滅非洲豬瘟疫情，依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》《重大動物疫情應急條例》《國家突發(fā)重大動物疫情應急預案》等法律法規(guī)，制定本規(guī)范。
1. 適用范圍
本規(guī)范規(guī)定了非洲豬瘟的診斷、疫情報告和確認、疫情處置、防范等防控措施。
本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)與非洲豬瘟防治活動有關(guān)的單位和個人。
2. 診斷
2.1 流行病學
2.1.1 傳染源
感染非洲豬瘟病毒的家豬、野豬(包括病豬、康復豬和隱性感染豬)和鈍緣軟蜱為主要傳染源。
2.1.2 傳播途徑
主要通過接觸非洲豬瘟病毒感染豬或非洲豬瘟病毒污染物(泔水、飼料、墊草、車輛等)傳播，消化道和呼吸道是最主要的感染途徑；也可經(jīng)鈍緣軟蜱等媒介昆蟲叮咬傳播。
2.1.3 易感動物
家豬和歐亞野豬高度易感，無明顯的品種、日齡和性別差異。疣豬和藪豬雖可感染，但不表現(xiàn)明顯臨床癥狀。
2.1.4 潛伏期
因毒株、宿主和感染途徑的不同而有所差異。OIE《陸生動物衛(wèi)生法典》規(guī)定，家豬感染非洲豬瘟病毒的潛伏期為15天。
2.1.5 發(fā)病率和病死率
不同毒株致病性有所差異，強毒力毒株可導致豬在 4～10天內(nèi)100%死亡， 中等毒力毒株造成的病死率一般為30%～50%，低毒力毒株僅引起少量豬死亡。
2.1.6 季節(jié)性
該病季節(jié)性不明顯。
2.2 臨床表現(xiàn)
2.2.1 最急性：無明顯臨床癥狀突然死亡。
2.2.2 急性：體溫可高達42℃，沉郁，厭食，耳、四肢、腹部皮膚有出血點，可視黏膜潮紅、發(fā)紺。眼、鼻有黏液膿性分泌物；嘔吐；便秘，糞便表面有血液和黏液覆蓋；或腹瀉，糞便帶血。共濟失調(diào)或步態(tài)僵直，呼吸困難，病程延長則出現(xiàn)其他神經(jīng)癥狀。妊娠母豬流產(chǎn)。病死率高達100%。病程4～10天。
2.2.3 亞急性：癥狀與急性相同，但病情較輕，病死率較低。體溫波動無規(guī)律，一般高于40.5℃。仔豬病死率較高。病程5～30天。
2.2.4 慢性：波狀熱，呼吸困難，濕咳。消瘦或發(fā)育遲緩，體弱，毛色暗淡。關(guān)節(jié)腫脹，皮膚潰瘍。死亡率低。病程2～15個月。
2.3 病理變化
漿膜表面充血、出血，腎臟、肺臟表面有出血點，心內(nèi)膜和心外膜有大量出血點，胃、腸道粘膜彌漫性出血。膽囊、膀胱出血。肺臟腫大，切面流出泡沫性液體，氣管內(nèi)有血性泡沫樣粘液。脾臟腫大，易碎，呈暗紅色至黑色，表面有出血點，邊緣鈍網(wǎng)，有時出現(xiàn)邊緣梗死。頜下淋巴結(jié)、腹腔淋巴結(jié)腫大，嚴重出血。
2.4 鑒別診斷
非洲豬瘟臨床癥狀與古典豬瘟、高致病性豬藍耳病等疫病相似，必須開展實驗室檢測進行鑒別診斷。
2.5 實驗室檢測
2.5.1 樣品的采集、運輸和保存
2.5.2 血清學檢測
抗體檢測可采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗和間接熒光抗體試驗等方法。
血清學檢測應在符合相關(guān)生物安全要求的省級動物疫病預防控制機構(gòu)實驗室、中國動物衛(wèi)生與流行病學中心(國家外來動物疫病研究中心)或農(nóng)業(yè)部指定實驗室進行。
2.5.3 病原學檢測
2.5.3.1 病原學快速檢測：可采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗、聚合酶鏈式反應和實時熒光聚合酶鏈式反應等方法。
開展病原學快速檢測的樣品必須滅活，檢測工作應在符合相關(guān)生物安全要求的省級動物疫病預防控制機構(gòu)實驗室、中國動物衛(wèi)生與流行病學中心（國家外來動物疫病研究中心）或農(nóng)業(yè)部指定實驗室進行。
2.5.3.2 病毒分離鑒定：可采用細胞培養(yǎng)、動物回歸試驗等方法。
病毒分離鑒定工作應在中國動物衛(wèi)生與流行病學中心(國家外來動物疫病研究中心)或農(nóng)業(yè)部指定實驗室進行，實驗室生物安全水平必須達到BSL-3或ABSL-3。
2.6 結(jié)果判定
2.6.1 臨床可疑疫情
符合非洲豬瘟的流行病學特點、臨床表現(xiàn)和病理變化，判定為臨床可疑疫情。
2.6.2 疑似疫情
對臨床可疑疫情，經(jīng)上述任一血清學方法或病原學快速檢測方法檢測，結(jié)果為陽性的，判定為疑似疫情。
2.6.3 確診疫情
對疑似疫情，經(jīng)中國動物衛(wèi)生與流行病學中心（國家外來動物疫病研究中心）或農(nóng)業(yè)部指定實驗室復核，結(jié)果為陽性的，判定為確診疫情。
3. 疫情報告和確認
3.1 疫情報告
任何單位和個人發(fā)現(xiàn)家豬、野豬異常死亡，如出現(xiàn)古典豬瘟免疫失敗，或不明原因大范圍生豬死亡的情形，應當立即向當?shù)孬F醫(yī)主管部門、動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)或者動物疫病預防控制機構(gòu)報告。
當?shù)乜h級動物疫病預防控制機構(gòu)判定為非洲豬瘟臨床可疑疫情的，應在2小時內(nèi)報告本地獸醫(yī)主管部門，并逐級上報至省級動物疫病預防控制機構(gòu)。
省級動物疫病預防控制機構(gòu)判定為非洲豬瘟疑似疫情時，應立即報告省級獸醫(yī)主管部門、中國動物疫病預防控制中心和中國動物衛(wèi)生與流行病學中心；省級獸醫(yī)主管部門應在1小時內(nèi)報告省級人民政府和農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局。
中國動物衛(wèi)生與流行病學中心(國家外來動物疫病研究中心)或農(nóng)業(yè)部指定實驗室判定為非洲豬瘟疫情時，應立即報告農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局并抄送中國動物疫病預防控制中心，同時通知疫情發(fā)生地省級動物疫病預防控制機構(gòu)。省級動物疫病預防控制機構(gòu)應立即報告省級獸醫(yī)主管部門，省級獸醫(yī)主管部門應立即報告省級人民政府。
附件二：國家非洲豬瘟參考實驗室、專業(yè)實驗室和區(qū)域?qū)嶒炇颐麊?/strong>
一、國家非洲豬瘟參考實驗室
所在單位：中國動物衛(wèi)生與流行病學中心
地 址：青島市紅島經(jīng)濟區(qū)岙東南路21號
郵 編：266032
二、國家非洲豬瘟專業(yè)實驗室(哈爾濱)
所在單位：中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
地 址：黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)哈平路678號
郵 編：150069
三、國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?/div>
(一)國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?蘭州)
所在單位：中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
地 址：甘肅省蘭州市鹽場堡徐家坪1號
郵 編：730046
(二)國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?武漢)
所在單位：中國科學院武漢病毒研究所
地 址：武漢市武昌區(qū)小洪山中區(qū)44號
郵 編：430071
(三)國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?廣州)
所在單位：華南農(nóng)業(yè)大學
地 址：廣州市天河區(qū)五山路483號
郵 編：510642
- 下一篇：加快研究進度 做好生豬期貨上市的技
- 上一篇：中國強勁需求下，多國雞肉猛漲價
版權(quán)聲明：
1. 轉(zhuǎn)載本網(wǎng)內(nèi)容，請注明來源“中國肉類機械網(wǎng)”，或與本網(wǎng)聯(lián)系，違者將追究法律責任。
2.本網(wǎng)轉(zhuǎn)載刊登的文章以信息傳播為目的，僅代表作者個人觀點，版權(quán)由原作者或供稿方所擁有，并不構(gòu)成投資建議，據(jù)此操作，風險自擔。
3. 如果轉(zhuǎn)載文章涉及您的合法權(quán)益和版權(quán)問題，或者轉(zhuǎn)載出處出現(xiàn)錯誤，請及時與本網(wǎng)聯(lián)系進行刪除。
4. 友情提醒：網(wǎng)上交易有風險,請買賣雙方謹慎交易,謹防上當受騙！
5. 投稿與合作熱線：010-88133989， E-mail：mpmpc@126.com
